磷脂茶多酚复合物的制备及其对淡水鱼松的抗氧化作用

林亚楠 王海星 阳丽红 戴志远 陈 康 沈 清*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310012

2 温州医科大学附属第二医院 浙江温州 325000）

茶多酚（Tea polyphenols，TPP）又叫茶单宁，茶鞣质，是茶叶中多羟基酚类及其衍生物的总称，主要包括儿茶素类、黄酮类、花青素和酚酸类物质[1]。其中，儿茶素类占茶多酚总量的60%～80%，是茶多酚中含量最高的组分，具有许多生理活性如抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、减肥等[2]。而茶多酚的多酚羟基结构极性较大，水溶性强而脂溶性差，且其自身的物化稳定性差，含有不愉悦的味道，极大地限制了其在食品工业中的应用。

磷脂结构主要由甘油骨架、极性基团和不同长度和饱和度的脂肪酸链组成。根据磷脂极性基团不同可将磷脂分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等类别[3]。磷脂是维持细胞结构的重要组成部分，也是新陈代谢不可或缺的营养元素，其具备广泛的生物学功能，诸如活化细胞，维持代谢与荷尔蒙分泌均衡，增强人体免疫力等[4]。由于磷脂同时含有亲水相和亲油相基团，所以可以用来包封、运载和缓释水溶性、油溶性和两亲性物质[5]。将茶多酚与磷脂在一定条件下复合，得到天然活性成分磷脂复合物，既改变了茶多酚的理化性质，增加了其脂溶性，掩盖不愉悦风味，还提高其稳定性以及在不同环境下抗氧化缓释性能。

鱼松是用鱼类肌肉制成的金黄色绒毛状调味干制品[6]。鱼松产品含有较多不饱和脂肪酸类物质，极易氧化生成腥臭味小分子化合物，影响产品保质期。本试验针对上述问题合成了磷脂茶多酚复合物（Tea polyphenol phospholipids complex，TPP-PL），测定其溶解性、缓释性、抗氧化性。研究磷脂茶多酚复合物对贮藏期内鱼松过氧化值和鱼松脂肪酸成分的影响，以延长鱼松的保质期，扩大茶多酚的应用途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶多酚（纯度98%，主要成分EGCG为50.4%），杭州禾田生物技术有限公司；磷脂酰胆碱（96%），美国Avanti Polar Lipids公司；胆固醇，美国Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、无水乙醇、氯仿，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱系统，美国Agilent公司；PHSJ-4A型实验室pH计，中国上海雷磁公司；Sanorius BS110S分析天平，北京赛多利斯公司；RE52-05旋转蒸发仪，上海亚荣公司；T6紫外分光光度计，美国Thermo公司；MDF-382E超低温冰箱，日本Sanyo公司；Milliplus 2150超纯水处理系统，美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 磷脂茶多酚复合物制备 称量大豆卵磷脂30 g于烧瓶中，加入到500mL氯仿中搅拌溶解；同时溶解20 g茶多酚于500mL乙醇中；将茶多酚乙醇溶液倒入烧瓶中，边搅拌边逐渐升温至40℃后搅拌2 h，使用旋转蒸发减压蒸馏除去有机溶剂直至成膜，加入50mL含有10%蔗糖冻干保护剂的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 6.5），继续旋蒸使膜溶解并充分水合，得到磷脂茶多酚复合物混悬液。将其转移至容量瓶中，于-80℃快速冷冻2 h，至于真空冷冻干燥机干燥过夜，冻干后将样品置于4℃保存。

1.3.2 分配系数K值 称取0.1 g茶多酚和磷脂茶多酚复合物，分别加入一定量的超纯水和非极性溶剂（氯仿或乙酸乙酯）使样品充分溶解，再向其中加入等体积的非极性溶剂和超纯水，剧烈振荡后静置，茶多酚和磷脂茶多酚复合物样品在两相中自动分配，分离两相溶液并定容至100mL，使用液相色谱测定两相中茶多酚含量，以非水相中茶多酚含量与水相中茶多酚含量之比值即为K值。

1.3.3 体外释放率 茶多酚的体外释放模拟参照Fang等[7]的试验方案，具体步骤：取5mL磷脂茶多酚复合物样品，加入至经预处理的10 ku透析袋中，扎好透析袋口并置于含100mL PBS等渗溶液（0.05mol/L，pH 6.0）的烧杯中，于（37±0.5）℃下恒温水浴低速搅拌。分别于0.1，0.2，0.4，0.8，1，2，4，6，8，10，12 h 取 5mL 透析液，以 PBS 溶液作为对照测定波长275 nm下吸光度，计算各个时间点的茶多酚释放量。

1.3.4 抗氧化

1.3.4.1 DPPH清除自由基 将茶多酚和茶多酚磷脂复合物分别稀释成4个质量浓度25，50，75，100μg/mL，各取0.1mL样品加入至2mL无水乙醇中，然后向其加入60μg/mL的DPPH溶液1.5 mL，充分混合均匀后放置暗室反应30min。反应结束后置于波长517 nm下测定吸光度，由式（1）计算得到样品的清除自由基活性：

式中，A——空白样品与DPPH反应后的吸光值；B——样品经上述反应后的吸光值；C——空白样品与无水乙醇的混合物的吸光值。

1.3.4.2 FRAP抗氧化 制备10mmol/L TPTZ溶解在 40 mmol/L的盐酸溶液，20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液，0.3mol/L醋酸缓冲液（pH 3.6），并将三者按1∶1∶10混合均匀后即得到FRAP试剂。将茶多酚和磷脂茶多酚复合物分别配制4个质量浓度20，30，40，50μg/mL，取 4.8mL FRAP 试剂与 0.2 mL样品混合置于37℃反应10min。待反应结束后于593 nm波长处测定吸光值。

1.3.5 鱼松样品的制备 鱼松的制备参照汪小玲等[6]工艺并做改进，将淡水鲫鱼清洗去除内脏置于高压蒸汽锅内蒸30min，冷却后去除鱼皮、脂肪及刺，加生姜料酒煮制去腥后用压榨机压榨，分成3等份，一份不做处理，另外两份分别加入茶多酚、磷脂茶多酚复合物，分别搓松后加食盐、白砂糖及豌豆粉文火炒松直至含水量在12%左右，旺火炒酥后冷却罐装贮藏备用。

1.3.6 过氧化值（POV）测定 过氧化值的测定参照国家标准GB/T5538-2005，单位为meq/kg。脂质氧化的初始产物是过氧化物，过氧化物极不稳定，氧化能力强，能将碘化钾氧化成游离碘，根据析出碘量计算过氧化值。

1.3.7 脂肪酸检测

1.3.7.1 甲酯化 甲酯化参照Folch等[8]方法，将0.1 g鱼松样品与2mL的NaOH-MeOH溶液（0.5 mol/L）混合后振荡摇匀，在65℃的水浴锅中加热30min，取出后冷却至室温，再加入2mL的BF3-MeOH溶液，振荡混匀，在65℃水浴锅中继续加热3min，取出并自然冷却后加入2mL正己烷提取，同时加入饱和NaCl溶液稀释，取出上清液后在其中加入少量无水硫酸钠，取上清液用于气相色谱分析。

1.3.7.2 气相色谱条件 色谱柱：HP-88毛细管色谱柱（30m × 0.25mm，0.2 μm）；载气：高纯氮气；恒流：0.65mL/min；进样量：1 μL；分流比：40∶1；进样口温度：250℃；升温程序：初温50℃，保持2min，以4℃/min升至220℃维持15min。

1.4 数据处理

每个试验重复3次，结果表示为平均数±SD，采用WPS Excel软件分析数据，显著性分析用SPSS进行统计检验，平均数间的显著性差异分析P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 亲水亲脂分配系数K值

茶多酚是白色无定形结晶状物质，易溶于水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯和丙酮，难溶于氯仿和正丁醇，脂溶性较差，影响了抗氧化效果和油脂外观，限制了其在油脂食品方面的应用[9]。合成的磷脂茶多酚复合物的亲水亲脂性大小可通过亲水亲脂分配系数K值得出，K值越大脂溶性越强，越小则水溶性较好[10]。由表1可知，在氯仿-水体系中，茶多酚具有良好的水溶性，难溶于氯仿故K值较小（0.002）远低于磷脂茶多酚复合物的K值（150.8），说明与磷脂复合的茶多酚亲脂性得到很大的提高，茶多酚在乙酸乙酯-水体系中的K值（4.574）较氯仿-水体系大，是由于茶多酚可溶于乙酸乙酯，从乙酸乙酯相和水相EGCG含量可以看出茶多酚溶于乙酸乙酯能力强于溶于水的能力，而磷脂茶多酚复合物的亲水性明显减小，其K值（21.33）远大于茶多酚（4.574），再次证明磷脂茶多酚复合物亲脂性较茶多酚强。可以推断出磷脂茶多酚能与含有较多脂肪酸的鱼松紧密结合，发挥茶多酚的抗氧化作用，具有良好的应用前景。

表1 茶多酚和磷脂茶多酚复合物在两相溶剂中的分配系数比较Table1 The performance comparison of TPP and TPP-PL in the hydrophilic and hydrophobic solvent system

2.2 体外释放率

提高茶多酚在鱼松中的缓释性是本试验制备磷脂茶多酚复合物的主要目标之一。由图1可知，茶多酚及磷脂茶多酚在体外释放模拟试验中趋势大致相同，均为前5 h茶多酚的释放量上升较快，之后释放量上升较慢并趋于稳定，而磷脂茶多酚样品的茶多酚释放量远低于茶多酚样品，25 h后茶多酚样品体外茶多酚释放量高于磷脂茶多酚60%以上。由此可知，磷脂包覆茶多酚形成脂质体后可延长茶多酚在鱼松中的保留时间，在鱼松组织结构间隙具有缓慢释放茶多酚的特性，对延长鱼松的贮藏期具有重要作用。

2.3 抗氧化

图1 茶多酚和磷脂茶多酚复合物体外释放率Fig.1 The releasing rates of TPP and TPP-PL

通过DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力试验，可分别测试茶多酚和磷脂茶多酚复合物在有机相和水相环境下的抗氧化能力。茶多酚复合物是由一个或者多个带有羟基的苯环组成，羟基通过贡献出氢原子，形成稳定的苯氧基自由基，从而猝灭体系中游离自由基的存在[11]。

从图2可以看出茶多酚和磷脂茶多酚复合物的体外抗氧化活性的大小与其质量浓度有关，DPPH自由基清除率随抗氧化剂质量浓度的提高而增加，并且呈一定的线性关系。相同质量浓度下茶多酚的抗氧化能力略优于磷脂茶多酚复合物，差异并不显著。抗氧化剂质量浓度为50，75，100，125μg/mL时，茶多酚的DPPH自由基清除能力为58.9% ±3.63%，67.3%±4.64%，72.1%±5.61%和75.2%±4.59%，而磷脂茶多酚复合物在相同质量浓度下的清除能力为51.7%±2.44%，59.2%±2.54%，63.7%±2.87%和67.5%±2.95%。Zou等[12]报道了一种使用乙醇注射和动态高压微流法制备茶多酚脂质体，其DPPH自由基清除率与未包覆茶多酚相当。Peres等[13]发现儿茶素与经阿拉伯胶麦芽糊精包埋的儿茶素具有相同的DPPH自由基清除能力，表明阿拉伯胶麦芽糊精包埋的方法保留了儿茶素的抗氧化活性。磷脂复合能保持茶多酚的抗氧化能力，主要由于DPPH自由基清除能力测定环境为无水乙醇，而磷脂茶多酚复合物在乙醇溶剂中易发生破乳现象，使被包裹的茶多酚分子暴露在DPPH反应体系中。

在pH值较低时，无色的三价铁复合物Fe3+-三吡啶三吖嗪（Tripyridyl-triazine，TPTZ）通过茶多酚抗氧化剂的供电子作用而转变成蓝色的二价铁复合物，并且在593 nm波长处有最大吸收峰，根据吸光值的大小可以判断出抗氧化能力的强弱[14]。茶多酚和磷脂茶多酚复合物的铁离子还原能力均属于浓度依赖型，且其抗氧化能力与质量浓度成正比。由图3可见，在抗氧化剂质量浓度为20，30，40，50μg/mL 时，经 FRAP 试验茶多酚的铁离子还原能力为（438.9±26.6），（720.1±47.8），（827.6±56.3），（930.4 ± 66.9） μmol/mL；磷脂茶多酚复合物的铁离子还原能力为（265.4±14.7），（485.3±27.6），（596.9±321.1），（710.8±32.3） μmol/mL。经过脂质体包封之后，茶多酚的铁离子还原能力显著降低。Arts等[15]曾报道了绿茶组分因为与酪蛋白和白蛋白作用，遮蔽了其抗氧化活性。Donsì等[16]发现白芦藜醇和姜黄素经固体油脂基质包封后，铁离子还原能力也有所降低。造成这种差异的主要原因是茶多酚包覆在脂质体水相中，因为没有破乳处理，其供电子能力受到磷脂双分子的干扰，进而导致磷脂茶多酚复合物的铁离子还原能力降低。

图2 不同质量浓度的茶多酚和磷脂茶多酚复合物体外DPPH自由基清除能力Fig.2 The radical scavenging activities of TPP and TPP-PL in different mass concentrations

图3 不同质量浓度的茶多酚和磷脂茶多酚复合物FRAP抗氧化值Fig.3 The FRAP values of TPP and TPP-PL in different mass concentrations

2.4 脂质过氧化值

过氧化物是脂质氧化酸败的初始产物，通常以过氧化物的产生作为脂质氧化酸败的开始。过氧化物与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，以滴定的体积计算生成过氧化物的含量。当鱼松中含有茶多酚等抗氧化剂时，其生成的过氧化物的量就减少，即POV值降低，以POV值的高低判定抗氧化剂性能的优劣。由图4可知，前5 d茶多酚及磷脂茶多酚均能有效抑制鱼松脂肪氧化酸败，POV值基本保持为0，贮藏5 d后POV值均开始上升，添加磷脂茶多酚复合物的鱼松过氧化值上升较添加茶多酚的鱼松过氧化值上升的缓慢。这验证了磷脂茶多酚的缓释性，磷脂茶多酚，复合物能长时间保留在鱼松中持续释放茶多酚，抑制鱼松脂肪氧化酸败，另有研究表明磷脂本身具有还原作用，能修复被氧化的儿茶素分子[17]，所以磷脂茶多酚复合物延长鱼松贮藏期的效果强于茶多酚单体。

图4 不同贮藏期内茶多酚和磷脂茶多酚复合物对鱼松过氧化值的影响Fig.4 The effect of TPP and TPP-PL on the POV value of freshwater fish floss during storage

2.5 脂肪酸成分变化

脂肪酸成分的测定需先进行甲酯化，把高沸点、不易气化的脂肪酸酯水解或皂化成脂肪酸和甘油，再使脂肪酸与甲醇反应生成相应脂肪酸甲酯，变成低沸点易气化的物质，从而降低气化温度，有利于气相色谱法分离，并逐一测定其组成及含量[18]，脂肪酸甲酯的变化对应脂肪酸的变化。经测定，鱼肉原料、鱼松（未处理）、TPP鱼松及TPPPL鱼松的脂肪酸成分及相对含量见表2。由结果可知，4种不同样品中均检出23种脂肪酸，且脂肪酸种类相同，包括：9种饱和脂肪酸，其中含量最多的均为棕榈酸；6种单不饱和脂肪酸，含量最多的均为油酸；8种多不饱和脂肪酸，含量最多的均为亚油酸，虽然原料鱼为淡水鱼但二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）均有检出。原料鱼炒制成鱼松后，9种饱和脂肪酸含量均有增加，硬脂酸含量增加最为显著，增加了23.28%，在不饱和脂肪中除了花生一烯酸含量略有升高，其它不饱和脂肪酸含量均有减少，其中亚油酸含量变化最为显著，减少了11.02%。可能是油脂中的碳氢键键能较小，容易断裂形成自由基，不饱和双键的存在会使碳氧键更容易断裂成自由基，鱼松炒制过程中各种加热处理容易导致不饱和脂肪酸碳氢键获得能量产生自由基被氧化[19]，部分不饱和脂肪酸可转化为饱和脂肪酸。相比鱼肉原料，鱼松（未处理）、TPP鱼松及TPP-PL鱼松中的饱和脂肪酸有所增加，不饱和脂肪酸相应减少，其中加入茶多酚的鱼松的硬脂酸含量增加了12.05%，远大于磷脂茶多酚鱼松的硬脂酸增量（1.46%），不饱和脂肪亚油酸含量减少了8.26%，大于磷脂茶多酚鱼松的亚油酸变化（4.29%），说明茶多酚及磷脂茶多酚均能抑制鱼松脂肪氧化等反应，而磷脂茶多酚保持鱼松脂肪酸成分的效果较茶多酚显著，磷脂茶多酚能保护不饱和脂肪酸，减少损失或转化，磷脂茶多酚鱼松中各种脂肪酸含量均与原料鱼相近，磷脂茶多酚鱼松的EPA损失量（0.14%）及DHA损失量（0.23%）分别少于茶多酚鱼松EPA的损失量（0.45%）及DHA损失量（0.72%），而EPA和DHA是人体必需脂肪酸，对人体细胞膜功能和基因表达有重要作用，具有促进婴幼儿大脑发育，抑制血小板凝集，降血脂，防止动脉粥样硬化及老年痴呆等功效[20]，所以磷脂茶多酚添加到鱼松中不仅能延长贮藏期而且还能提高鱼松的营养功能性。

表2 鱼肉原料、鱼松及抗氧化处理后鱼松的脂肪酸甲酯成分与相对含量Table2 The composition and relative contents of fatty acid ethyl esters in freshwater fish tissue，fish floss and antioxidant-treated fish floss

（续表2）

3 结论

本研究合成了磷脂茶多酚，以茶多酚为对照，测定了其亲脂亲水性、体外茶多酚释放性、抗氧化性以及对淡水鱼松过氧化值及脂肪酸含量的影响。研究表明磷脂茶多酚的合成方法极大的提高了茶多酚脂溶性，消除了茶多酚的局限性，扩大了茶多酚应用范围。磷脂茶多酚因其亲脂性、缓释性和抗氧化性可以长久保存于鱼松中发挥抗氧化的作用，可有效提高鱼松的贮藏期，保护鱼松中EPA和DHA等不饱和脂肪酸营养成分，解决了传统鱼松保质期短等问题，为茶多酚在油脂食品等方面的应用提供了依据。