1-甲基环丙烯处理对台湾青枣果实采后病害的抑制

陈 莲 王璐璐 林河通 * 林艺芬 陈艺晖

（1 闽南师范大学生物科学与技术学院 福建漳州 363000

2 福建农林大学食品科学学院 福州 350002

3 亚热带特色农产品采后生物学（福建农林大学）福建省高校重点实验室 福州 350002

4 闽台特色园林植物福建省高校重点实验室 福建漳州 363000

5 福建农林大学农产品产后技术研究所 福州 350002）

台湾青枣（Ziziphus mauritiana Lamk.）又称印度枣、毛叶枣、滇刺枣，为鼠李科枣属，热带亚热带重要的果树。果实呈圆形或椭圆形，气味清香，果肉脆甜多汁，适宜鲜食。台湾青枣果实富含维生素、矿物质、纤维素且果实体外抗氧化和抗菌能力较强[1-2]。然而，台湾青枣果实采后贮运期间易发生病害，引起果实品质劣变，货架期在1周左右[3-4]。笔者们前期研究发现，“中青”台湾青枣果实在采后贮藏第6天果皮出现可见凹陷病斑，失去商品价值[4]。台湾青枣果实采后由病害引起的果实腐烂现象极其严重，损失高达40%。如何减少台湾青枣果实采后病害所造成的损失，已成为台湾青枣果实采后商品化处理亟待解决的问题[5-6]。

Singh等[7-8]从采前台湾青枣果实表面分离出32种真菌，并对成熟果实人工接种分离出病原菌，结果发现分离出的大部分真菌能引起台湾青枣果实不同程度的腐烂，因此认为台湾青枣果实在采前、采后及运输贮藏过程中易被真菌侵染，贮藏期间发生病害而引起腐烂，特别是成熟度高的台湾青枣果实，其中黄曲霉（Aspergillus flavus）在整个过程中均存在并引起采后腐烂。Singh等[9]进一步从采后台湾青枣果实中分离出18种真菌，发现黄曲霉感染与果实腐烂相关系数为85.7%，导致维生素C大量流失。Surolia等[10]从55种台湾青枣果实中分离出影响果实贮藏并与采后病害有关的12株菌种。赵丹丹等[11]从市售的台湾青枣中分离出互隔交链孢（Alternaria alternata）、草茎点霉（Phoma herbarum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）等共 24 株霉菌和6株细菌。真菌病害在台湾青枣果实采后贮运过程最常发生，为减少采后病害损失，杀菌剂处理可有效抑制链格孢（Alternaria alternata）、曲霉菌（Aspergillus niger）等真菌引起的采后果实腐烂[12-14]。Nallathambi等[13]用木霉属（Trichoderma）和杀菌剂处理采后台湾青枣果实，认为木霉和低浓度杀菌剂结合使用可完全控制台湾青枣采后链格孢引起的病害。目前台湾青枣果实采收后一般采用化学防腐剂处理，常温下贮运[15]。人们多年来连续使用化学防腐剂进行病菌控制，使得病菌产生抗药性，不仅降低化学防腐剂的防腐保鲜效果，还造成果蔬产品的农药残留，直接危害人们健康，污染环境。人们迫切希望采用一种非化学方法来延缓台湾青枣果实后熟衰老，增强采后抗病性，减轻采后腐烂，延长货架期。

1-甲基环丙烯（1-MCP）因安全、无毒和使用方便而被广泛用于果蔬采后商品化处理，从而延长贮藏寿命及货架期。近年来研究发现适宜浓度1-MCP处理不仅能有效控制采后果实的果肉软化和腐烂问题，而且在诱导果实抗病性方面效果尤为显著，如1-MCP处理能有效抑制枣、杨桃、苹果、猕猴桃、芒果等采后病害[16-22]；林媛等[17]研究发现杨桃果实采收后经1-MCP处理可提高果实抗病性，认为这与抗病相关酶活性诱导上升有关；张艳宜等[18]、周晓婉等[19]进一步将1-MCP处理的采后猕猴桃、苹果果实接种灰霉菌（Botrytis cinerea）后在20℃下贮藏，结果表明1-MCP处理显著抑制病斑的扩大速度，提高抗病相关酶（PAL，GLU，CHI）活性；Xu 等[20]、Li等[21]和Du 等[22]将采收后的芒果、苹果、西红柿果实先分别接种炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、青霉菌（Penicillium expansum）、灰霉菌后再进行1-MCP处理，结果表明1-MCP处理明显抑制采后腐烂，延长果实品质，同时还进行了1-MCP对主要致病菌炭疽菌、青霉菌、灰霉菌的离体抑菌试验，首次报道1-MCP在体外可直接抑制炭疽菌、青霉、灰霉的孢子萌发和菌丝生长。另有研究报道对链格孢的体外抑菌实验，1-MCP无抑制作用[23]。Jiang等[24]研究不同浓度1-MCP处理对草莓果实采后病害的控制，提出病害的控制与抗病相关酶PAL及其产物酚类物质有关。张艳宜等[18]、周晓婉等[19]进一步将1-MCP处理的采后猕猴桃、苹果果实接种灰霉菌，发现果实PAL酶活性上升，总酚、类黄酮和木质素的含量增加，病害得到有效的控制。笔者前期研究表明1.8μL/L 1-MCP处理可减少台湾青枣果实采后腐烂。到目前为止，未见1-MCP处理对采后台湾青枣果实贮藏期间病害控制效果及抗病相关酶活性影响的研究报道。本文研究“中青”台湾青枣果实采收后，用1.8μL/L 1-MCP处理后对果实贮藏期间病害发生、总酚、木质素及抗病相关酶活性的影响，以期为台湾青枣果实采后病害控制新技术的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料及前处理

以约八成熟采自福建省漳州平和县山格镇示范科技果园的“中青”台湾青枣（Ziziphus mauritiana Lamk.cv.Zhongqing）为试验材料。果实采收当天运至福建农林大学农产品产后技术研究所。剔除伤病虫果，把经过挑选的大小和色泽基本一致的健康果实用清水清洗后晾干待用。笔者们前期研究结果表明，经1.8μL/L 1-MCP处理12 h的“中青”台湾青枣果实品质最好[4]。本试验1-MCP选取的浓度为1.8μL/L。1-MCP采用从台湾利统股份有限公司购买的纸片型AnsiP-S（商品名：安喜布）。

①1-MCP处理：纸片型1-MCP按浓度要求剪裁后，用蒸馏水喷湿平放在果实上，（15±1）℃下泡沫箱内密封处理12 h。②对照（CK）：果实在（15±1）℃下泡沫箱内密闭12 h。上述每一处理重复3次，每次30 kg。将各组果实用0.015mm厚的聚乙烯薄膜袋包装，每袋10个。台湾青枣果实在（15±1）℃下贮藏，每隔3 d取样观察台湾青枣果实腐烂、病害情况并测定相关指标。

1.2 测定方法

1.2.1 果实腐烂指数和病害指数的测定 每次随机取5袋（共50个果实），按照参考文献[25]的方法测定台湾青枣果实腐烂指数，按照参考文献[26]的方法测定台湾青枣果实感病指数。腐烂指数=Σ（腐烂级别×该级果实数）／最高腐烂级别×总果数；果实病害指数=Σ（病害级数×该级果数）/（总果数×发病最重级的代表数值）。

1.2.2 果实几丁质酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）活性的测定 从10个台湾青枣果实中取果肉5.0 g，按照参考文献[27-28]的方法测定台湾青枣果实CHI和GLU活性，结果以U/mg蛋白表示。

1.2.3 果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定从10个果实中取5 g果肉，按照参考文献[27]的方法测定台湾青枣果实PAL活性，结果以U/mg蛋白表示。

1.2.4 果实总酚含量的测定 按照参考文献[27]的方法测定台湾青枣果实总酚含量，以没食子酸作标准曲线，结果以mg·g-1FW表示。

1.2.5 果实木质素含量的测定 从30个果实中取40 g果肉，按照参考文献[29]的方法测定台湾青枣果实木质素含量。木质素=（抽滤后重-抽滤前滤纸重）/样品干重×100%，结果以%表示。

1.2.6 果实酶提取液的蛋白质含量测定 按照参考文献[30]的方法测定台湾青枣果实酶提取液的蛋白质含量。

1.3 数据分析

各指标测定均重复3次，数据采用SPSS 16.0数据分析软件进行方差分析（ANOVA），Ducan多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 1-MCP处理对台湾青枣果实病害指数和腐烂指数的影响

由图1a可知，台湾青枣果实在整个采后贮藏期间，对照和1-MCP处理的果实病害发生的严重程度随着贮藏时间的延长不断加重。在贮藏0～3 d内，对照台湾青枣果实病害指数缓慢上升，而1-MCP处理在贮藏0～3 d内无感病，感病指数为0；在贮藏3～15 d内，对照台湾青枣果实病害指数随贮藏时间的延长快速上升，而1-MCP处理的病害指数缓慢上升；到贮藏第15天时，对照台湾青枣果实病害指数高达0.63，病害严重，而经1-MCP处理的病害指数仅为0.29。比较发现，在台湾青枣果实采后整个贮藏期间，经1-MCP处理的果实病害指数始终低于对照，且在贮藏6～15 d内1-MCP处理极显著（P＜0.01）低于对照，表明1-MCP处理可减轻台湾青枣果实病害指数的上升，抑制台湾青枣果实采后病害的发生和发展，减少采后由病害引起的腐烂损失。

由图1b可知，台湾青枣果实在采后贮藏过程中，对照和1-MCP处理的果实腐烂严重程度随着贮藏时间的延长不断加重。在贮藏0～3 d内，对照和1-MCP处理的果实没出现腐烂现象，腐烂指数为0；在贮藏3～15 d内，对照台湾青枣果实腐烂指数快速上升，果实腐烂程度明显加重，腐烂指数变化很大；到贮藏第15天时，果实腐烂指数高达0.61。1-MCP处理的腐烂指数在贮藏3～9 d内缓慢上升，果实腐烂程度逐渐加重；在贮藏9～15 d内果实腐烂指数较快上升，果实腐烂程度明显加重，到贮藏第15天时，1-MCP处理的腐烂指数为0.30。比较发现，在台湾青枣果实采后整个贮藏期间，经1-MCP处理的果实腐烂指数均低于对照，且在贮藏6～15 d内1-MCP处理的腐烂指数极显著（P＜0.01）低于对照，由此说明1-MCP处理可有效降低台湾青枣果实贮藏期间腐烂指数的升高，减轻采后损耗。

图1 1-MCP处理对采后台湾青枣果实病害指数和腐烂指数的影响Fig.1 Effects of 1-MCP treatment on disease index and decay index of harvested Indian jujube fruit

2.2 1-MCP处理对台湾青枣果实β-1，3-葡聚糖酶（GLU）活性的影响

由图2可知，在贮藏0～6 d内，对照台湾青枣果实GLU活性基本没变化；GLU活性从贮藏第6天开始快速上升，至贮藏第9天，GLU活性停止上升快速下降。与对照组相比较，1-MCP处理后果实的GLU活性在贮藏0～6 d内缓慢上升；从贮藏第6天开始GLU活性显著升高，在贮藏第9天GLU活性达到最大值，其活性分别是采收当天的37.4倍、对照的1.73倍；随后GLU活性明显下降，而仍高于对照。由于GLU是植物体内重要的病程相关酶之一，经1-MCP处理的果实GLU活性在整个贮藏过程中始终高于对照，且在贮藏6～12 d内，1-MCP处理的果实GLU活性极显著（P＜0.01）高于对照，由此说明1-MCP处理诱导了GLU活性的上升，增强了台湾青枣果实在贮藏期间的抗病性。

图2 1-MCP处理对采后台湾青枣果实β-1，3-葡聚糖酶活性的影响Fig.2 Effects of 1-MCP treatment on β-1，3-glucanase activity of harvested Indian jujube fruit

2.3 1-MCP处理对台湾青枣果实几丁质酶（CHI）活性的影响

由图3可知，在台湾青枣果实整个贮藏期间，对照CHI活性总体呈下降趋势，在贮藏0～3 d内对照果实CHI活性缓慢下降，从贮藏第3天开始对照果实CHI活性快速下降，贮藏6～12 d内对照CHI活性几乎没变化。与对照相比，1-MCP处理的CHI活性在贮藏0～3 d内快速上升；随后1-MCP处理CHI活性明显下降，而CHI活性仍高于对照，在贮藏9～12 d内CHI活性再次快速上升。由于CHI是植物体内重要的病程相关酶之一，台湾青枣果实经1-MCP处理后果实CHI活性在整个贮藏期间始终高于对照，如在贮藏第15天时，台湾青枣果实经1-MCP处理后CHI活性为对照的2.45 倍，两者差异极显著（P＜0.01），由此表明，台湾青枣果实采后经1-MCP处理诱导果实CHI活性上升，增强了台湾青枣果实在贮藏期间的抗病性。

2.4 1-MCP处理对台湾青枣果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响

由图4可知，在台湾青枣果实贮藏0～3 d内，对照果实PAL活性快速下降而1-MCP处理PAL活性较快下降；在贮藏3～6 d内，对照果实PAL活性缓慢上升而1-MCP处理PAL活性快速上升；对照和1-MCP处理的PAL活性在贮藏6～12 d内均下降，在贮藏12～15 d内，对照PAL活性缓慢上升而1-MCP处理PAL活性快速下降。进一步比较发现，1-MCP处理的果实PAL活性除贮藏第3、15天外，均高于采收当天，而对照果实PAL活性均低于采收当天；在台湾青枣果实整个贮藏期内，1-MCP处理的果实PAL活性始终高于对照果实，如贮藏第6天时，1-MCP处理的果实PAL活性为0.57U/mg蛋白，对照果实PAL活性为0.21 U/mg蛋白，两者差异极显著（P＜0.01）。上述结果表明，1-MCP处理诱导果实PAL活性的上升，增强了台湾青枣果实在贮藏期间的抗病性。

图3 1-MCP处理对采后台湾青枣果实几丁质酶活性的影响Fig.3 Effects of 1-MCP treatment on chitinase activity of harvested Indian jujube fruit

图4 1-MCP处理对采后台湾青枣果实苯丙氨酸解氨酶活性的影响Fig.4 Effects of 1-MCP treatment on phenylalanine ammonialyase activity of harvested Indian jujube fruit

2.5 1-MCP处理对台湾青枣果实总酚和木质素含量的影响

由图5a可知，1-MCP处理和对照果实总酚含量在贮藏0～3 d内快速下降，到第3天达到最低值，1-MCP处理的果实总酚含量为对照总酚含量的1.1倍；之后对照果实总酚含量快速上升，从贮藏第9天开始对照果实总酚含量开始下降直到贮藏结束；而1-MCP处理从贮藏第3天开始果实总酚含量快速上升，至贮藏第12天1-MCP处理的果实总酚含量才开始下降，经1-MCP处理的台湾青枣果实总酚含量除贮藏第3、15天外均高于采收当天。比较发现，在整个贮藏期间1-MCP处理的果实总酚含量始终高于对照果实，如贮藏第12天1-MCP处理的果实总酚含量为对照的1.15倍，两者差异极显著（P＜0.01）。以上说明台湾青枣果实采后经1-MCP处理诱导果实总酚的生成和积累，增强了台湾青枣果实在贮藏期间的抗病性。

由图5b可知，1-MCP处理和对照果实木质素含量在贮藏0～6 d内快速上升，在贮藏第6天时，1-MCP处理和对照果实木质素含量达到最高值，1-MCP处理的果实木质素含量为对照的1.38倍。对照果实木质素含量随后快速下降，在第9天时达到最低值，随后上升。而1-MCP处理的果实木质素含量在贮藏6 d后下降。进一步比较发现，在台湾青枣采后整个贮藏期间，1-MCP处理的果实木质素含量始终高于采收当天且均高于对照。如贮藏第9天1-MCP处理的果实木质素含量为对照的4.48倍，采收当天的4.3倍，上述结果表明，1-MCP处理诱导了台湾青枣果实木质素的生成和积累，增强了果实采后抗病性。

图5 1-MCP处理对采后台湾青枣果实总酚和木质素含量的影响Fig.5 Effects of 1-MCP treatment on total phenolics and lignin content of harvested Indian jujube fruit

3 讨论

采后台湾青枣果实病原菌侵染导致贮藏期间的腐烂损失高达40%[5-6]。人们常用杀菌剂处理采后台湾青枣果实来抑制由病害引起的腐烂[11-13]。由于杀菌剂残留和环境污染等问题，人们倾向寻找新的绿色环保的保鲜处理方法。诱导果蔬自身的抗病性来减轻果蔬采后病害，被认为是最环保、最有效的办法[5-6，31]。近年来的研究发现，植物乙烯具有两面性，一方面促进采后果蔬衰老成熟，有利于采后病原菌的侵染，另一方面在果蔬遭受病原菌侵染后调节系统获得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）和诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR）发展的信号网络中起着关键作用[32-34]。1-MCP（新型乙烯受体抑制剂）由于其无毒、环保、方便的特性被广泛用于果蔬贮藏保鲜并用于研究乙烯在果蔬诱导抗病性中的作用。近几年来，人们研究发现适宜浓度的乙烯受体抑制剂1-MCP处理能有效抑制台湾青枣、枣、杨桃、猕猴桃、苹果等果实采后病害的发生和发展[4，16-21]。张艳宜等[18]、周晓婉等[19]用1-MCP分别处理采后猕猴桃、苹果果实后接种灰霉菌，结果发现1-MCP处理能有效抑制接种后病斑的面积和深度的扩大。本文研究表明，1.8μL/L 1-MCP处理能有效抑制台湾青枣果实采后贮藏期间病害指数（图1a）和腐烂指数（图1b）的上升。

苹果果实采后经1-MCP处理后接种灰霉菌，贮藏期间腐烂率低而且在1-MCP处理的果实中观察到病程相关蛋白（CHI，GLU，PAL）活性的升高，认为1-MCP可能通过诱导抗病相关酶活性的升高来减轻采后果实的腐烂[19]。病程相关蛋白β-1，3-葡聚糖酶（GLU）、几丁质酶（CHI）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）被认为在植物防御中发挥了至关重要的作用[35]。GLU能通过降解病原体细胞壁而直接作用于病原体，或通过诱导细胞释放寡糖而诱导防御反应[36]。几丁质酶通过催化构成侵染果实的真菌细胞壁成分几丁质水解而直接作用于病原体。而单一几丁质酶的抑菌活性很弱，这是因为真菌成熟时其顶端的几丁质酶层被其它物质如β-1，3-糖苷等包裹，几丁质酶没办法接触到菌丝内的几丁质[37]。如GLU和CHI两种酶共同作用于真菌细胞壁可大大提高单一抗病相关酶的抗病性。人们认为，植物对真菌感染的防御机制之一是细胞内CHI和GLU配合共同作用水解入侵真菌细胞壁聚合物[38]。本文研究表明，台湾青枣果实经1-MCP处理后GLU和CHI活性在贮藏前期（0～3 d）均升高，两种抗病相关酶共同水解入侵果实的真菌细胞壁，直接作用于病原体增强采后果实对病菌的抗性（图2、3）；贮藏第9天，1-MCP处理的果实GLU活性达到最大值（图3），说明1-MCP可能通过诱导台湾青枣果实增加GLU的合成，增强对入侵真菌细胞壁的水解能力从而抑制侵染真菌的生长与繁殖，增强抗病性。苹果果实1-MCP处理后接种灰霉菌，不仅果实病害的发展受到抑制而且在1-MCP处理的果实中检测到苯丙氨酸途径PAL活性的上升，认为1-MCP可能通过诱导PAL活性的升高来降低采后苹果果实的腐烂[19]。PAL作为苯丙氨酸途径的第一个酶，与植物体内抗病性相关代谢产物（酚类化合物、木质素、植保素）的生物合成密切相关，其代谢产物酚酸参与植保素的积累，木质素的生物合成和结构性障碍的形成，起间接抵抗病原体的主要作用[39-40]。Paradeep等[41]研究认为，台湾青枣果实的化学组成，如TSS、糖、叶绿素等对果实采后抗病性无明显作用。本文研究表明，在台湾青枣果实整个贮藏期间，1-MCP处理的PAL活性、总酚和木质素含量一直保持在较高水平（图4、5a、5b），说明 1-MCP 可能通过诱导或活化苯丙氨酸途径关键酶PAL，促进抗病物质总酚、木质素的生成和积累，加快木质素等结构性障碍的形成，而起到抵抗病原体的作用，增强了抗病性。

4 结论

1-MCP处理可能启动了台湾青枣抗病相关蛋白应答，一方面通过诱导抗病相关酶（CHI和GLU）活性的上升，直接降解病原菌细胞壁，形成采后抗病性的第一道防线；另一方面通过诱导PAL活性上升，激活苯丙氨酸途径，增加总酚和木质素的生成和积累，加快结构性障碍的形成，形成采后抗病性第二道防线。两道防线共同作用增强了贮藏期间台湾青枣果实的抗病性，减少由采后病害引起采后损耗，降低腐烂率和病害指数，延长了果实的贮藏寿命和货架期。