乳酸菌发酵对脱脂米糠营养成分的影响

刘 磊 冉玉兵 张名位 文 伟 张瑞芬 赵广河

（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 农业农村部功能食品重点实验室广东省农产品加工重点实验室 广州 510610）

米糠是糙米精白过程的副产物，约占糙米质量的8%，主要由种皮、珠心层、糊粉层及胚组成[1]。米糠富含蛋白质、脂肪、矿物质及维生素等多种营养成分，同时富含多酚类物质等植物活性成分，是一种“天赐营养源”[2]。我国米糠年产量约1800万t[3]，主要用作动物饲料等，被廉价消耗，利用率低，造成了资源浪费。探寻米糠的高值转化利用技术成为科研工作者亟待解决的问题[4]。

近年来微生物发酵技术被广泛用于大宗粮食副产物的开发利用中[5]。有报道称微生物发酵能加强米糠的生物活性，如Kim等[6]发现米糠经酵母菌发酵后具有降血压和抗疲劳等功效；Park等[7]利用芽孢杆菌固态发酵米糠可增强其对肝损伤小鼠的护肝作用。然而，这些研究缺乏对米糠中生物活性成分的分析。酚类物质是植物中重要的生理活性成分。现代流行病学调查表明膳食中增加酚类物质的摄入可以降低肥胖症等慢性疾病的发病率[8]。糙米中的酚类物质主要集中在米糠层，多以结合态形式存在[1，9]。Schmidt等[10]利用米根霉固态发酵米糠，可使米糠中的酚类化合物含量较发酵前提高110%，且抗氧化活性显著提高，然而未分析发酵过程中还原糖的变化。乳酸菌作为可食用菌种，广泛应用于食品发酵工业中，可以提升食品的营养价值，赋予其良好的食用品质[11]。Luana等[12]研究表明乳酸菌发酵燕麦粉可以显著提高其总酚和可溶性膳食纤维以及生理活性物质β-葡聚糖的含量，同时还可改善燕麦粉的风味。

课题组前期研究比较了保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和肠膜明串珠菌等5种单一乳酸菌对还原糖和可溶性酚的影响[13]。相比较单一菌种发酵，复合菌种能产生更丰富的风味物质。目前关于复合乳酸菌发酵对米糠中酚类物质及营养成分的影响鲜有研究报道。本研究以脱脂米糠为原料，通过半干法酶解米糠为乳酸菌发酵提供糖源，采用降糖和释放可溶性酚类物质能力为指标建立复合乳酸菌半固态发酵脱脂米糠的最优工艺条件，同时对发酵前、后脱脂米糠的营养成分进行比较分析，旨在为开发米糠发酵粉，为拓宽米糠的加工途径提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料 乳酸菌株：保加利亚乳杆菌（GIM 1.155）、嗜酸乳杆菌（GIM 1.731）、植物乳杆菌（GIM 1.648）、干酪乳杆菌（GIM 1.204）、肠膜状明串珠菌（GIM 1.357），广东省微生物菌种保藏中心。

脱脂米糠：本实验室自制。新鲜米糠清理粉碎，过60目筛，经CO2超临界萃取脱脂处理。水分含量9.56%，淀粉含量41.11%，蛋白含量14.28%，膳食纤维含量24.65%，灰分含量9.13%。

MRS培养基，广东环凯生物科技有限公司；高温 α-淀粉酶（20 000U/g，最适 pH 6.0），尤特尔生物技术有限公司，食品级；其它试剂均为国产分析纯级。

1.1.2 试验仪器 HA420-40-200二氧化碳超临界萃取设备，海安华安超临界设备有限公司；SWCJ-2FD无菌操作台，上海博讯实业有限公司；RHS-250-Z-Ⅱ恒温恒湿培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；K8400型蛋白质分析仪，瑞典FOSS公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪，日本HITACHIL公司；Biofuge Stratos Sorvall高速冷冻离心机，美国Thermo公司；UV-1240型紫外-可见分光光度计，日本岛津分析仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 米糠的乳酸菌发酵工艺流程 米糠发酵工艺参考前期研究[10]，具体流程如下：

图1 工艺流程图Fig.1 The roadmap of the process

工艺要点如下：

（1）半干法酶解米糠的制备：100 g新鲜脱脂米糠与含有高温α-淀粉酶的去离子水按质量体积比1∶1.5的比例混合后，搅拌均匀，分装于三角瓶中密封，于100℃蒸30min，121℃杀菌15min，冷却备用。

（2）菌种活化及复壮培养：5株乳酸菌及其保藏物（保加利亚乳杆菌、乳酸链球菌、植物乳杆菌、酪乳杆菌和肠膜状明串珠菌）置于MRS肉汤中进行活化，30℃，静止发酵24 h，取1mL活化后的菌悬液，扩大培养2代，得复壮培养后的菌悬液（9 lg CFU/mL）。

（3）乳酸菌发酵：将复壮后的乳酸菌分别接种入（1）中制备好的半干法酶解米糠中，初始接种量为1.0%，发酵温度为30℃。

1.2.2 不同复合乳酸菌菌种发酵米糠效果比较试验 根据预试验，将上述复壮后的5株乳酸菌两两复配，比例为1∶1，接种到制备好的半干法酶解米糠中，30℃恒温培养24 h，测定发酵前、后米糠中可溶性酚类物质和还原糖含量的变化，并以不发酵组为空白对照。

1.2.3 复合乳酸菌菌种发酵米糠单因素试验 选取发酵后米糠中的还原糖和可溶性酚类物质含量变化为考察指标，分别考察接种量、菌种配比、发酵温度和发酵时间对考察指标的影响，单因素试验设计如下：

（1）接种量：设定复合菌种配比为1∶1，发酵温度30℃，发酵时间24 h，接种量设定为1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%和6.0%。

（2）菌种配比：按照（1）中确定的条件，A、B菌种配比设定为1∶0，1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1和0∶1。

（3）发酵温度：按照（1）和（2）确定的条件，发酵温度设定为25，30，35，40℃和45℃。

（4）发酵时间：按照（1）、（2）和（3）中确定的条件，发酵时间设定为12，24，36，48 h和60 h。

1.2.4 相关指标的测定

（1）还原糖含量的测定 准确称取5 g发酵米糠，置于50mL小烧杯中，加入30mL去离子水，磁力搅拌30min，转移至50mL离心管中，4 000 r/min离心10min，取上清液，定容至50mL，采用DNS比色法测定其中还原糖的量，测定总糖时上清液先经水解、中和并定容后采用DNS法测定，结果均以每克干基葡萄糖毫克量（mg glucose/g）表示，简写为（mg/g）。

（2）可溶性酚类物质的提取和测定 参考Xu等[14]的方法提取可溶性酚类物质。准确称取5 g发酵脱脂米糠，加入50mL去离子水，10 000 r/min均质5min，4 000 r/min离心收集上清液。向水相中加入4mol/L NaOH溶液50mL，充满氮气密封，室温下振荡4 h。所得碱化液用6mol/L HCl溶液调节pH值至2后，分别用100mL乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取相，在45℃下旋蒸至干，残余物用甲醇定容至10mL，得发酵脱脂米糠可溶性酚类物质提取液，贮存于-20℃冰箱备用。称样和提取均重复3次。

参考Singleton等[15]方法测定可溶性酚类物质含量。移取0.125mL酚类物质提取液，加入0.5 mL去离子水和0.125mL福林酚试剂，混匀后静置6min，再加入1.25mL 7%碳酸钠溶液和1mL去离子水，混匀后在25℃下避光静置90min，于760 nm波长下测其吸光值。同时以0.125mL甲醇代替提取液作空白对照，以没食子酸标准品制作标准曲线。总酚含量以每100 g干基中所含没食子酸当量（mg gallic acid equivalents/100 g dry weight）表示，简写为（mg GAE/100 g DW）。

1.2.5 发酵米糠提取物基本组成测定 100 g脱脂米糠经半干法酶解后，接种入复合乳酸菌，按照上述优化后的工艺发酵，热水浸提4 h后，4 000 r/min离心取上清，将发酵上清提取液冻干成粉，得到发酵米糠浸提物，测定相关营养成分含量。淀粉含量的测定：GB/T 5009.9-2008；还原糖含量的测定采用DNS比色法；碳水化合物含量的测定：GB/Z 21922-2008；蛋白质含量的测定：GB 5009.5-2010；蛋白氨基酸组成测定：GB/T 5009.124-2003；膳食纤维含量的测定：GB/T 5009.88-2008；可溶性膳食纤维含量参考AACC 920.153（2011）方法测定；灰分含量的测定：GB 4800-84。可溶性酚类的提取和测定参考1.2.4节（2）中的方法。样品制备和测定均重复3次。其中原料利用率、淀粉转化率、可溶性膳食纤维得率、蛋白提取率计算公式如下：

1.2.6 米糠提取物中蛋白营养价值评价 参考胡秋辉等[16]的方法，采用氨基酸比值系数法对发酵米糠提取物中蛋白营养价值进行评价。即根据氨基酸平衡理论，利用WHO/FAO的必需氨基酸模式，计算样品中必需氨基酸（Essential amino acids，EAA）的氨基酸比值（Ratio of amino acids，RAA），氨基酸比值系数（Ratio coefficient，RC）和比值系数分数（Score of ratio coefficient，SRC）。

式中，CV——RC的变异系数，CV=标准差/均数。由于一般食物各种氨基酸比值往往不相同，故可计算氨基酸比值的均数。按照公式（5～7）分别计算各米糠蛋白的RAA、RC、SRC值。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS19软件检验分析比较试验各组间均值差异显著性（P＜0.05），响应面试验采用design expert软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同复合乳酸菌菌种发酵米糠效果比较

淀粉是米糠的主要化学成分，如何在水分含量较低的条件下，降解淀粉为乳酸菌生长提供可利用糖，成为发酵利用米糠的关键。本研究采用高温α-淀粉酶在蒸汽条件下降解米糠中的淀粉，为乳酸菌的生长提供碳源[17]。此外，前期研究发现不同乳酸菌的降糖能力和释放酚类物质的能力密切相关[13]，而现代流行病学表明摄入米糠多酚可以预防癌症、糖尿病、肥胖症等慢性疾病[18-21]，因此，本文同时以还原糖含量和可溶性总酚含量为考察指标。图2为不同复合乳酸菌发酵对脱脂米糠中还原糖和可溶性总酚含量的影响。从图中可以看出，不同复合乳酸菌发酵对米糠中还原糖和可溶性总酚含量的影响显著（P＜0.05），复合乳酸菌发酵后，米糠中的还原糖含量显著下降，可溶性总酚含量显著提高，这主要是由于发酵过程中糖类物质被降解利用，导致还原糖含量降低，而米糠细胞壁上的糖及蛋白质等营养物质被利用降解的同时，与之结合的酚类物质被释放出来，导致可溶性总酚含量升高[17，22]。其中植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌复合发酵，降糖和释放可溶性酚类物质的能力明显优于其它复合菌种。因此，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为本次发酵最适复合乳酸菌菌种。

图2 不同复合乳酸菌发酵对米糠中还原糖（a）和可溶性总酚（b）含量的影响Fig.2 Effects of different complex strains on the content of reducing sugar（a） and total soluble phenolics（b） of rice bran

2.2 复合乳酸菌发酵米糠单因素优化

2.2.1 不同接种量对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响 图3为不同复合菌种接种量对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响。从图中可以看出，随着接种量的增加，发酵米糠中的还原糖含量呈显著下降趋势（P＜0.05），可溶性总酚含量呈先稍微升高后不变的趋势。当复合菌种接种量达到5.0%后，发酵米糠中的还原糖含量和可溶性总酚含量均不再有显著性变化（P＞0.05），因此选定接种量为5.0%为最适接种量。

2.2.2 菌种配比对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响 图4为不同菌种配比对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响。从图中可以看出，嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌间的配比对发酵米糠中的还原糖含量和可溶性总酚含量均无显著性影响（P＞0.05），因此确定菌种配比为1∶1。

图3 不同接种量对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响Fig.3 Effects of complex strain inoculation amount on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran

图4 不同菌种比例对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响Fig.4 Effects of complex strains matching shift on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran

2.2.3 发酵温度对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响 图5为不同发酵温度对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响。从图中可以看出，发酵米糠中的还原糖含量随发酵温度的升高呈先下降后上升趋势，当发酵温度为35℃时，还原糖含量显著低于其它水平值（P＜0.05）。可溶性总酚含量随着发酵温度升高呈先不变后下降趋势，当温度超过35℃后，发酵米糠中可溶性总酚含量显著下降（P＜0.05）。因此，综合判断复合菌种发酵米糠时最适温度为35℃。

图5 不同发酵温度对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响Fig.5 Effects of the fermentation temperature on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran

2.2.4 发酵时间对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响 图6为不同酵时间对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响。从图中可以看出，随着发酵时间的延长，发酵米糠中的还原糖含量呈逐渐降低的趋势，可溶性总酚含量呈先上升后下降趋势，当发酵时间为36 h时，与发酵时间24 h比较发现米糠中还原糖含量显著降低（P＜0.05），而可溶性总酚含量无显著变化，因此选择36 h为最适发酵时间，此时脱脂米糠中可溶性酚含量是102.3mg GAE/100 g DW，还原糖含量是60.6mg/g。

图6 不同发酵时间对发酵米糠中还原糖含量和可溶性总酚含量的影响Fig.6 Effect of the fermentation time on the content of reducing sugar and total soluble phenolics of rice bran

2.3 发酵米糠热水浸提物营养特性评价

2.3.1 基本组成表1为发酵前、后米糠提取物的基本营养成分比较。从表中可以看出，发酵后米糠提取物中可溶性固形物、碳水化合物、可溶性膳食纤维、蛋白和可溶性总酚含量显著高于未发酵米糠（P＜0.05）。对比发酵前、后提取物中基本组成可知，发酵后米糠提取物中可溶性固形物、碳水化合物、可溶性膳食纤维、蛋白和可溶性总酚含量分别提高了 31.42%，21.82%，112.21%，65.54%和37.14%。

表1 发酵前、后米糠提取物的基本组成（g/100g DRB）Table1 Fundamental components of rice bran extract before and after fermentation（g/100g DRB）

米糠的细胞壁是由纤维素、蛋白质及淀粉等大分子形成的复杂三维结构，溶解性较差[23]。本研究在蒸汽条件下采用高温α-淀粉酶降解淀粉可使米糠中的还原糖提高6倍左右[13]，这是碳水化合物增加的主要原因。陈丽莉[24]对乳酸菌发酵前、后的豆渣膳食纤维进行分析，结果表明乳酸菌发酵可以降解豆渣中由阿拉伯糖、木糖和糖醛酸等组成的不溶性膳食纤维，从而使豆渣中的可溶性膳食纤维含量提高，这可能是本研究中发酵后米糠提取物中可溶性膳食纤维含量显著提高的原因。刘晶晶等[25]研究表明复合乳酸菌发酵可以提高柳枝稷粗蛋白含量，这与本研究中乳酸菌发酵后提取物中蛋白含量显著提高的结果一致。闵伟红[26]的研究指出乳酸菌发酵过程中产生大量的乳酸可以促进蛋白质的溶出。此外，乳酸菌在生长繁殖过程中产生的菌体蛋白也是可溶性蛋白质增加的原因之一[27]。复合乳酸菌发酵后，米糠中的可溶性酚类物质含量显著提高。Razak等[28]报道复合霉菌发酵增加了米糠中的游离酚。这与本研究的结果相一致。米糠中的不溶性结合酚类物质以酯键、糖苷键、醚苷键等与细胞壁上的纤维素及蛋白质等大分子相结合，乳酸菌在发酵过程中产生糖苷酶、蛋白酶及阿魏酸酯酶降解了米糠细胞壁上的大分子物质，从而释放出与之相结合的酚类物质[17，29]。

2.3.2 蛋白质的氨基酸组成与营养价值表2为发酵前、后米糠提取物中蛋白质的氨基酸含量分析。从表中可以看出，发酵前、后蛋白的氨基酸含量有显著性变化，乳酸菌发酵使得发酵后蛋白的必需氨基酸比例提高了21.23%，其中异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸含量分别提高了 47.18%，49.78%，13.73%，9.0%，75.26%，24.06%（P＜0.05），同时，发酵米糠提取物的必需氨基酸与非必需氨基酸比值较发酵前提高了33.33%。氨基酸含量的变化和乳酸菌发酵过程中产生的蛋白酶种类、氨基酸及肽的代谢、有机酸的酸化等因素密切相关[30]，具体原因有待进一步研究。Zhao等[31]研究发现乳酸菌发酵可以提高麦麸中亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等氨基酸的含量。这种差异可能是由于原料的组成及使用的乳酸菌不同导致。

为了进一步对蛋白营养价值进行评价，本文采用氨基酸比值系数法进行评价，结果如表3所示。如果食物蛋白质的EAA组成比例与EAA模式一致，则 CV=0，SRC=100，相比较而言，SRC 越接近100，其营养价值相对越高。比较可知乳酸菌发酵显著提高了脱脂米糠中的蛋白营养价值。

表2 发酵前、后米糠提取物蛋白质的氨基酸组分（mg/g蛋白）Table2 Animo acids components of proteins in rice bran extract before and after fermentation（mg/g protein）

表3 发酵前、后米糠提取物中蛋白质的必需氨基酸的RAA、RC和SRC值Table3 RAA，RC，SRC value of the essential amino acids of protein in the rice bran extract before and after fermentation

3 结论

本文以脱脂米糠为原料，采用降糖和释放可溶性酚类物质能力为指标，筛选确定了用于发酵的复合乳酸菌，分别考察接种量、菌种配比、发酵温度和发酵时间等单因素对考察指标的影响，优化了脱脂米糠复合乳酸菌半固态发酵的工艺条件：复合菌种为嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌，菌株比例1：1，复合菌株添加量5.0%，发酵温度35℃，发酵时间36h。发酵米糠热水浸提物中可溶性固形物、碳水化合物、可溶性膳食纤维、可溶性蛋白含量和可溶性总酚含量分别为38.27%，27.02%，4.52%，2.93%和105.60mg GAE/100 g DW，相比于未发酵米糠分别提高了31.42%，21.82%，112.21%，65.54%和37.14%（P＜0.05）。对发酵脱脂米糠蛋白质的氨基酸组成与营养价值分析发现，发酵米糠提取物中必需氨基酸的含量提高了21.23%，其与非必需氨基酸比值为0.48，较未发酵米糠提高了33.33%，并且必需氨基酸的SRC值更接近100，由此说明发酵米糠提取物的营养价值更高。以上结果表明，乳酸菌发酵可以改善米糠的营养价值，使其成为风味良好的配料应用在食品加工业中。本研究可以为脱脂米糠的高值化利用提供指导。