精氨酸酶II:一种 “不同寻常” 的酶

刘 畅,罗 蓉,杜吉佩,李 秀∗

(1.成都医学院,基础医学院,四川养老与老年健康协同创新中心老年心血管疾病研究所,成都 610500;2.成都医学院,人体解剖与组织胚胎学教研室;发育与再生四川省重点实验室,成都 610500)

1 精氨酸酶

精氨酸酶是一种可以将精氨酸转化成鸟氨酸和尿素的锰金属酶,在细菌、酵母、植物、无脊椎动物、脊椎动物中都有发现。 绝大多数的无脊椎动物、植物、细菌和酵母的精氨酸酶仅仅只有一种亚型,并且存在于线粒体中[1-2]。 在人类和哺乳动物体内,存在着两种精氨酸酶同工酶:精氨酸酶I 和精氨酸酶II,由两条染色体上两个不同的基因编码。

在人类体内,精氨酸酶I 定位于6q23 染色体上,编码322 个氨基酸;而精氨酸酶II 定位于14q24染色体上,编码354 个氨基酸。 虽然这两种同工酶由不同基因编码,但是结构相似,氨基酸残基的同源性超过50%,在催化L-精氨酸代谢功能关键区域具有100%的同源性。 在亚细胞水平,精氨酸酶I 主要位于细胞质内,精氨酸酶II 主要位于线粒体内。尽管精氨酸酶I 和精氨酸酶II 都是水解L-精氨酸产生L-鸟氨酸和尿素,但是这两种同工酶的功能却取决于特定器官或细胞。 例如在内皮细胞中,精氨酸酶I 或者精氨酸酶II 的酶活性或者表达水平增加会减弱血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)产生的血管保护性物质NO。 然而在巨噬细胞中,精氨酸酶I 和精氨酸酶II 似乎具有相反的功能作用。 因为精氨酸酶I 在肝中大量表达,所以精氨酸酶I 最主要的功能是参与肝尿素循环,去除氨基酸代谢产生的过量氮;精氨酸酶II 在肝细胞中不表达。 研究显示,精氨酸酶I 基因敲除小鼠表现出严重的高氨血症症状,并在出生后10 ～14 d 死亡[3],从而证实了肝精氨酸酶I 的重要作用。 基因突变所致精氨酸酶I缺乏症患者表现为尿素循环紊乱、高精氨酸血症,并伴有进行性神经功能损害、发育迟缓以及伴随早期儿童肝硬化和肝癌的肝功能异常[4-5]。 精氨酸酶I 除了在肝中表达外,还发现在胃、胰腺、肺中有表达[6]。 精氨酸酶I 在这些器官中的功能尚不清楚。 与精氨酸酶I 不同的是,精氨酸酶II 主要存在于肾、大脑、前列腺、肠道和胰腺中[6-8],目前精氨酸酶II 在这些器官中的作用未知。 在临床研究中,精氨酸酶的激活与心、肺、肾的缺血再灌注损伤、高血压、勃起功能障碍、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌梗死等疾病的发生发展密切相关[9]。 其中,精氨酸酶II 在某些心血管疾病和巨噬细胞中的作用研究成为目前探讨的热点之一,本文就精氨酸酶II 在心血管疾病和巨噬细胞中所起的作用进行综述。

2 精氨酸酶II 在心血管疾病中的作用

目前一氧化氮(NO) 被公认为是血管舒张因子之一。 已经证实血管内皮NO 生物利用度降低最能反映病理条件下的内皮细胞功能障碍[10]。 NO 的前体是L-精氨酸,L-精氨酸也是eNOS 的底物。 当精氨酸酶II 的活性增强时,它可以与eNOS 竞争其共同底物L-精氨酸。 一旦当L-精氨酸的供应量不足以产生NO 时,eNOS 就会产生较少的NO 并且会跟更多的分子氧形成超氧化物(这个过程叫做eNOS-解耦联)[11-12]。 这些超氧化物会迅速地与可用的NO 反应形成过氧亚硝酸盐,进一步降低NO 的产生并通过氧化辅助因子BH4 进一步解偶联eNOS[13]。有证据表明,eNOS 解偶联在一些内皮功能障碍疾病中起着重要的作用,包括高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血/ 再灌注损伤、 糖尿病血管病变以及衰老[14]。

2.1 精氨酸酶II 与动脉粥样硬化

炎症、血管收缩和血栓形成参与了动脉粥样硬化的发生发展过程。 血管内皮功能受损被认为是动脉粥样硬化的早期和关键因素,导致动脉管壁异常和斑块形成。 越来越多的证据表明氧化低密度脂蛋白(OxLDL) 参与动脉粥样硬化[15-17]发生发展的机制。 动脉粥样硬化模型中精氨酸酶II 的活性和表达增加,OxLDL 通过氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)和激活Rho 激酶(ROCK)介导这种升高,LOX-1 激活精氨酸酶II 导致eNOS 解偶联并减少NO 生成。 此外,药物抑制LOX-1 和ROCK 可以减弱内皮细胞精氨酸酶II 的活性,并且发现动脉粥样硬化载脂蛋白E / 精氨酸酶II 双敲除小鼠(ApoE-/-Arg-/-)血管动脉粥样硬化斑块减少,氧化应激降低并且增加NO 产生。 OxLDL 通过线粒体加工肽酶(MPP)将精氨酸酶II 从线粒体迁移到胞浆,从而引起精氨酸酶II 的激活。 MPP 的敲除阻止OxLDL 诱导精氨酸酶II 移位,阻断了eNOS 的解偶联和改善了血管功能[18]。 Rafnsson 等[19]证 明 内 皮 素-1(endothelin-1,ET-1)与精氨酸酶II 在人动脉粥样硬化斑块坏死中心和内皮细胞中都有表达,而且ET-1刺激内皮细胞精氨酸酶II 的表达,使其活性增加以及引起巨噬细胞ROS 的形成。 Koo 等[20-21]发现精氨酸酶II 的敲除可以抑制由于nLDL 引起的人主动脉平滑肌细胞线粒体膜电位( mitochondrial membrane potential,MMP)丧失和p38MAPK 磷酸化的产生,并且证明精氨酸酶II 的活性通过Ca2+摄取调节MMP 的变化,Ca2+摄取对p38 MAPK 磷酸化和IL-8 的产生至关重要。 在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)中,精氨酸酶II 下调通过p32 增加Ca2+浓度, 激活CaMKII/ AMPK/ p38 MPAK/ Akt/ eNOS 信号通路。在这一信号转导途径中,由于精氨酸酶II 的下调,p38 MAPK 的抑制增加了NO 的产生,减少ROS 的生成,并增强了乙酰胆碱诱导的血管舒张[22]。 由此可见,精氨酸酶II 是参与动脉粥样硬化发生发展的重要因子之一,在动脉粥样硬化动物模型和短期临床干预研究中,精氨酸酶II 的抑制可以很好地降低斑块负荷,改善NO 生成,恢复内皮功能,因此靶向精氨酸酶II 可以为治疗与动脉粥样硬化相关的血管功能障碍和损伤提供有效方案[23-25]。

2.2 精氨酸酶II 与衰老/ 细胞老化

研究表明,由于衰老引起的细胞老化与胞内精氨酸酶II 活性/ 表达增加有关[26-28]。 Yepuri 等[26]发现,与幼龄小鼠相比,老龄小鼠精氨酸酶II 活性/表达更高,血管内皮NO 释放含量更低,超氧化物生成水平更高。 精氨酸酶II 的敲除可防止老龄小鼠eNOS 解偶联,减少超氧化物的产生。 Wu 等[28]证明,精氨酸酶II 通过p38MAPK、S6K1、eNOS 解偶联三者交互作用促使内皮细胞分泌炎性因子而加速衰老。 有研究报道,血管内皮细胞衰老与补充L-精氨酸有关。 Scalera 等[29]证明,长期给予L-精氨酸还可加速内皮细胞的衰老和减少NO 的生成。Xiong 等[30]报道,长期给予L-精氨酸诱导的内皮细胞衰老与精氨酸酶II 表达上调有关。 精氨酸酶II诱导的细胞老化涉及不同机制,在血管内皮细胞中,精氨酸酶II 通过核糖体蛋白S6 激酶β - 1(S6K1)引起eNOS 解偶联从而导致内皮细胞老化的发生,有趣的是,S6K1 也可以通过精氨酸酶II 引起细胞老化[26]。 在血管平滑肌细胞中,Xiong 等[31]的一项研究显示,精氨酸酶II 可以通过激活p66Shc和p53 诱导血管平滑肌细胞的衰老。 由此可见,精氨酸酶II 活性/ 表达增加是细胞老化/ 衰老的机制之一。

2.3 精氨酸酶II 与高血压

高血压是心血管疾病的主要危险因素,会引起NO 水平降低,超氧化物产生增多,eNOS 底物L-精氨酸、辅因子BH4 的水平降低,精氨酸酶II 的活性和表达增高。 肺动脉高压也与精氨酸酶II 活性增加有关,与全身性高血压相比,精氨酸酶II 在肺动脉高压中显得更为重要[32-34]。 此外,精氨酸酶II 水平升高减弱了实验性肺栓塞肺叶内皮依赖性血管舒张。 在全身和肺动脉高压时,精氨酸酶的上调与血压升高和内皮功能障碍有关系。 精氨酸酶抑制剂使L-精氨酸不被精氨酸酶II 过度消耗并且降低肺阻力从而缓解不同因素引起的肺动脉高压[35-40]。其中缺氧是一个重要因素,缺氧通过AMPKα 1 诱导精氨酸酶II 增加肺平滑肌细胞的增殖和精氨酸酶II含量[41]。 另外,Pandey 等[42]证明缺氧可以引起肺内皮细胞内精氨酸酶II 的转录。 精氨酸酶II 在系统性高血压和肺动脉高压中的参与机制尚不清楚,需要进一步的研究证实。

2.4 精氨酸酶II 与糖尿病血管病变

糖尿病与心血管疾病密切相关,成为糖尿病患者高发病率和高死亡率的主要原因。 1 型和2 型糖尿病均伴有血管功能障碍和损伤的征象,包括内皮依赖性舒张功能受损,平滑肌细胞的病理重构和血管顺应性降低。 研究发现,在糖尿病大鼠血管组织和糖尿病患者血浆中L-精氨酸含量降低[43-44]。 此外,在2 型糖尿病动物模型上的研究表明精氨酸酶抑制剂nor-NOHA 通过减少L-精氨酸利用和提高NO 生物利用度恢复冠状动脉微血管功能[45],并已在临床上得到验证[46]。 Yu 等[47]研究发现,在肥胖引起的糖尿病小鼠中,精氨酸酶II 通过p38MAPK通路导致内皮细胞eNOS 解偶联,从而进一步引起糖尿病血管病变。 精氨酸酶II 与糖尿病血管病变密切相关,因此靶向血管Arg-II 可能是治疗与糖尿病相关的血管疾病的新方法。

3 精氨酸酶II 在巨噬细胞中的作用

巨噬细胞是人体内重要的前哨细胞,参与维持组织稳态、免疫应答和炎症相关疾病。 巨噬细胞具有高度异质性,具有可塑性,在不同微环境刺激下表型可改变,其反应类型是促炎性M1 型( 杀伤细胞)和抗炎性M2 型(修复型细胞)。 M1 型巨噬细胞主要表达促炎和细胞毒性因子,例如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-12、MHC II 类分子和趋化因子IL-8 和CCL2,参与杀死细胞内寄生虫和肿瘤。 相反,M2 型巨噬细胞主要产生抗炎细胞因子和具有修复功能的物质,例如精氨酸酶/ 鸟氨酸、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β 和甘露糖受体,参与抗炎、组织修复、血管生成、过敏和肿瘤发展[48-49]。

精氨酸酶I 和精氨酸酶II 在巨噬细胞中都有表达,但是要依赖于外界刺激[50-51]。 大量研究表明,Arg-I 主要表达在M2 细胞中,并可通过限制细胞内L-精氨酸的利用减少iNOS 产生的NO,从而减弱炎症组织损伤和清除细胞内病原体[52-56]。 跟精氨酸酶I 不同的是,精氨酸酶II 在巨噬细胞表型调节和炎症反应中的作用和表达目前尚不清楚,甚至观点相悖。 早期一项研究表明,精氨酸酶II 基因是肝X受体的直接靶点,对巨噬细胞炎症基因的表达有抑制作用[57]。 而Ming 等[51]研究却发现,精氨酸酶II通过线粒体活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)促进巨噬细胞炎症反应或表现M1 表型,并成为慢性炎症性疾病发展的主要原因之一,如肥胖相关的胰岛素抵抗、II 型糖尿病和动脉粥样硬化。 其研究证明由LPS 激活的M1 型巨噬细胞仅上调小鼠和人巨噬细胞iNOS 和精氨酸酶II 的表达,但不上调精氨酸酶I 的表达。 在单核细胞/ 巨噬细胞系中沉默精氨酸酶II 基因降低了由LPS 或ox-LDL 刺激产生的促炎因子的水平,从而降低了与内皮细胞的粘附性。 此外,从精氨酸酶II 敲除小鼠(Arg-II-/-) 分离的巨噬细胞, 在LPS 的刺激下产生的促炎因子(MCP-1, TNF-α, IL-6, MMP14, 和iNOS) 比从野生型小鼠中分离的巨噬细胞产生的促炎因子水平显著降低。 而且将精氨酸酶II 基因转导到Arg-II-/-小鼠的巨噬细胞中后,在LPS 的刺激下产生的促炎因子比野生型小鼠巨噬细胞本身产生的要高。 重要的是,Arg-II-/-小鼠可以免于由于高脂饮食造成的肥胖所引起的全身性促炎巨噬细胞浸润和促炎因子的产生。 高脂饲养下的Arg-II-/-小鼠与野生型小鼠相比,虽然两组体重接近,但是Arg-II-/-小鼠显示出较低的空腹血糖浓度,并且具有更高的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。 另外,Liu 等[58]证明,精氨酸酶II 通过促进肝巨噬细胞炎症反应引起高脂食物诱导的肝脂肪变性,其机制是通过促进肝巨噬细胞炎症反应和TNF-α、IL-6 的释放,从而降低AMPK的活性,促进固醇调节元件结合蛋白-1c (SREBP-1c)的表达,进一步增强脂肪合成的有关酶的活性,最终增加肝脂肪的生成。 这些研究表明精氨酸酶II促进巨噬细胞分泌促炎因子从而导致不同疾病的发生,是M1 型巨噬细胞刺激因子之一。

但是最新的一项研究发现精氨酸酶II 敲除小鼠体内脊髓背角小胶质细胞比野生型小鼠的背角小胶质细胞分泌更多的促炎因子,产生更多的ROS和iNOS,说明精氨酸酶II 在脊髓背角小胶质细胞中呈抗炎作用,这跟之前的很多报道观点相悖,可能是精氨酸酶II 所在的巨噬细胞分布组织的不同导致的。 所以目前氨酸酶II 在巨噬细胞中的作用并不清楚,需要进一步的研究[59]。

4 结语

精氨酸酶II 在心血管功能障碍和损伤中的机制已经在动物模型和人类疾病的研究中得到很好的证实并且其作为慢性炎症性疾病(如衰老相关性血管功能障碍、动脉粥样硬化、II 型糖尿病和并发症)的治疗靶点,已经在基因修饰小鼠模型中显示出良好的疗效,所以研制特异的精氨酸酶II 抑制剂势在必行。 精氨酸酶II 在巨噬细胞中的作用已经有了初步的研究,但是巨噬细胞中精氨酸酶II 参与调节基因表达和酶活性的信号通路有待进一步研究,这些机制可以为特定靶向精氨酸酶II 提供可能性,从而间接治疗炎性疾病。 精氨酸酶同工酶的功能分析及其在巨噬细胞极化中的作用也有助于了解其他疾病,特别是癌症。 总之,对于精氨酸酶II及其下游靶点在其他疾病中如神经退行性疾病、视网膜疾病等的具体作用机制仍然还不清楚,需要我们进一步的研究。