吲哚三甲醇通过内质网应激-线粒体凋亡通路减轻棕榈酸诱导心肌细胞系H9c2氧化应激损伤

李 帅，鲍翠玉，李 晶

(湖北科技学院1. 药学院、2. 糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

据报道，高脂刺激可诱发心肌细胞出现内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)异常激活或线粒体介导的凋亡[1]。吲哚三甲醇(indole-3-carbinol，I3C)属于如甘蓝、白菜等十字花科蔬菜中的有效成分[2,3]，I3C对心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其机制目前尚无报道。本研究将探讨I3C对高脂所致心肌细胞损伤的保护作用及其机制与ERS-线粒体凋亡通路的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料H9c2心肌细胞，购自上海美轩生物科技有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自上海贝博生物科技公司；线粒体膜电位检测试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司；胎牛血清购自北京裕恒丰科技有限公司；MTT检测试剂盒、I3C、PA购自Sigma公司；一抗和二抗购自CST公司。

1.2 方法

1.2.1MTT检测 细胞加入96孔板，37 ℃内放置24 h，细胞贴壁后分组给药进行孵育，加入 MTT孵育4 h，再加入 150 μL DMSO，振荡混匀后，检测570 nm处OD值。

1.2.2ROS水平检测 6孔板内加入玻片，并加入细胞在37℃二氧化碳培养箱内放置24 h，细胞贴壁后分组给药，经洗涤、固定、再洗涤后，加入DHE(10 mmol·L-1)探针，37℃孵育30 min，洗涤、封片后检测细胞内荧光。

1.2.3线粒体膜电位检测 6孔板内加入玻片，并加入细胞在37℃二氧化碳培养箱内放置24 h，细胞贴壁后分组给药，经洗涤、固定、再洗涤后，加入JC-1探针，37℃孵育20 min，洗涤、封片后检测细胞内荧光。

1.2.4免疫印迹法检测 取20 μL的蛋白样品，分组加入样品槽内，进行蛋白电泳，并经转模及封闭后，进行下列抗体的孵育：GRP78、CHOP、p-PERK、p-IRE1、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2。一抗孵育结束后进行二抗孵育，经ECL化学发光，凝胶成像系统检测蛋白。

1.3 统计学方法数据采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析，组间差异的分析采用t检验和单因素方差分析。

2 结果

2.1 I3C对高脂诱导的心肌细胞增殖能力低下的影响我们用MTT实验观察了心肌细胞增殖率，发现PA刺激心肌细胞出现浓度依赖性及时间依赖性降低趋势，尤其PA在0.4 mmol·L-1刺激24 h时心肌细胞增殖率出现明显降低，并具有统计学意义(P<0.05)。I3C在200 μmol·L-1时，细胞增殖率明显恢复至正常水平，因此在下一步实验中I3C浓度设置为200 μmol·L-1。

2.2 I3C对高脂诱导的细胞内氧化应激及线粒体膜电位的影响ROS用红色荧光标记，PA组出现显著增强，PA+I3C组较PA组显著降低，说明PA显著增加细胞内氧化应激水平，I3C预处理可以逆转此改变；另一组数据表明，PA组线粒体膜电位显著下降，I3C预处理可以逆转此改变。

2.3 I3C对高脂诱导的心肌细胞ERS-线粒体凋亡通路的影响PA组GRP78、CHOP、p-PERK及p-IRE1蛋白表达明显升高(P<0.05)；预处理I3C可以显著降低上述蛋白的表达水平(P<0.05)。PA组Bcl-2水平明显下降(P<0.05)，Bax、cleaved caspase-3水平均明显升高(P<0.05)，而预处理I3C组可以明显逆转上述改变(P<0.05)。

3 讨论

本研究证实，心肌细胞对脂毒性损伤损伤比较敏感，会导致生存率的降低及氧化应激产物的增加，最终诱发凋亡，预处理吲哚三甲醇可以明显逆转这些改变，有效抑制心肌细胞的损伤。

我们进一步观察了ERS-线粒体凋亡通路和吲哚三甲醇作用机制的相关性。据报道，ERS的活化与线粒体细胞凋亡通路有一定相关性[4]。本研究结果提示，当心肌细胞受到脂毒性损伤时，细胞内ERS相关蛋白及线粒体促凋亡通路相关蛋白表达出现显著增加趋势，抗凋亡蛋白表达明显减少，而吲哚三甲醇预处理可以明显逆转上述变化。

综上，I3C能成功逆转高脂所致的心肌细胞增殖力下降，缓解氧化应激损伤及线粒体功能紊乱，本研究证实此作用与ERS-线粒体凋亡通路的调控密切相关。