兽用生物制品中支原体的污染来源及检测预防控制措施

2020-01-15张秀华路伟和彦良李淑芬胡尚竞赵倩雯叶双九苏玮玮

中国兽药杂志 2020年3期

张秀华，路伟，和彦良，李淑芬，胡尚竞，赵倩雯，叶双九，苏玮玮

(华威特(江苏)生物制药有限公司，江苏泰州 225300)

兽用生物制品是用微生物、微生物代谢产物、原虫、动物血液或组织等经加工制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。兽用生物制品的生物安全直接或间接地影响着人类的健康和安全，关注和重视兽用生物制品的质量，既能保障动物健康，更能保障全人类的健康，维护社会稳定。1898年，Nocard和Reux首次从患传染性胸膜肺炎病牛中分离出支原体。牛支原体可感染各年龄段的牛，可导致呼吸系统、生殖系统、角膜炎、乳腺炎及关节炎等疾病[1]。宿主对牛支原体的清除通常无效，并有可能参与到发病机制中。随着诊断技术的提高，人们对支原体的认识不断深入。目前，自然界中支原体近100余种，可直接或间接引起人类或动物的呼吸道感染、生长发育停滞及免疫系统损伤。支原体引起了医学界和兽医界的广泛关注[2]。

支原体是自然界中存在的最小、最简单的原核生物，大小介于细菌和病毒之间，可通过滤菌器，对许多抗生素有抗性，是细胞培养中一种常见的污染微生物。支原体可通过顶部的细胞器特异性和宿主细胞结合。这些顶部的细胞器含有高浓度的粘附蛋白，可粘附到真核细胞并穿入到细胞内部。支原体缺乏细胞壁，它们的胞膜可和宿主的细胞膜融合，且可交换其胞膜和胞浆成分。支原体污染在生物制品生产过程中依然是棘手的问题，近年来，特别是2006年我国全面强制实施兽药GMP以来，我国的生物制品行业取得了令人瞩目的成就，行业生产经营环境逐步规范，兽用生物制品的种类、数量不断增加，质量得到不断提升，产销量出现了前所未有的良好势头，为我国动物疫病防控，特别是重大动物疫病防控起到了关键作用[3]。但随着行业的不断发展，污染的问题依然存在，传统组织活疫苗和细胞毒活疫苗易受支原体污染，一旦污染则损失巨大[5]。经权威机构检测我国禽用活疫苗支原体污染率达70%以上。刘轶秋等汇总了2007-2011年间26家企业生产的22个品种141批制品的支原体检验情况，抽检的141批生物制品中支原体检验项合格批数为113批，不合格28批，合格率为80.1%[5]。吴华伟等统计了2008-2017年各类猪用病毒类生物制品不合格批次中，支原体检验不合格占比达19.8%，并建议应增加支原体的其它检验方法进行补充和完善，方能保证我国兽用生物制品的支原体检验的检出率和准确性[6]。英聪等在对市场上的兽用疫苗随机抽检中，检测出猪肺炎支原体、鸡毒支原体、滑液支原体和絮状支原体[7]，证明了我国兽用生物制品的支原体污染现象比较普遍。

1 兽用生物制品污染支原体的主要来源

1.1 细胞和种毒污染支原体种毒在疫苗生产中的作用至关重要，在某种程度上它是疫苗内在质量和属性特点的决定因素，若种毒污染了支原体，通过逐级培养放大，必然会影响疫苗的质量。在细胞培养过程中，支原体污染发生率达63%，因此，细胞培养过程中支原体污染仍是一个世界性的难题。污染细胞的支原体主要有人源、猪源和牛源三类，还有发酵支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、梨支原体、唾液支原体、莱氏无胆甾支原体和人型支原体[8]。实验室的工作人员是口腔支原体、发酵支原体和人型支原体的主要来源。精氨酸支原体和无胆甾原体主要来自胎牛血清和新生牛血清[9]。

1.2 血清和胰酶污染支原体血清作为疫苗生产中的主要原辅材料，极易被支原体污染。支原体是牛血清中常见的微生物之一，不能用除菌过滤膜除去[10]。现行版《中国兽药典》中生物制品生产和检验用牛血清质量标准中规定必须检验支原体，目的是保证牛血清培养的细胞及其制品无支原体污染。李明生等利用直接培养法、DNA荧光染色法和PCR法对17批新生牛血清样品进行了支原体检测，结果表明，应将直接培养法和DNA荧光染色法或PCR法同时联合应用，以提高血清中支原体检测的准确性。胰酶是疫苗生产过程中细胞传代、消化所需关键物料，取自羊、猪、牛等动物的胰腺，极易污染支原体。

1.3 鸡胚污染支原体 SPF鸡和鸡胚是禽用生物制品生产和检验环节的主要原材料，直接影响到产品质量和检验结果。国标《GB/T 17999.1-2008 SPF鸡微生物学监测第一部分：SPF鸡微生物学监测总则》中关于SPF鸡需监测19个项目，其中第4项和第5项要求检测鸡毒支原体和滑液囊支原体[11]。

1.4 原代细胞或动物组织污染支原体生产猪瘟活疫苗(细胞源)的细胞为牛睾丸原代细胞或羊睾丸原代细胞，牛或羊动物本身易感染支原体，且被毛较多，消毒不彻底易污染支原体。另外，猪瘟活疫苗(兔源)的生产需使用兔脾脏或淋巴结等组织，同样增加了支原体污染的风险。所以，利用动物组织生产兽用生物制品，污染支原体的风险极高，对接种动物存在较大的威胁。兽用生物制品的生产工艺快速提升，已从原来的原代细胞或动物组织工艺发展到传代细胞系培养，正向悬浮培养工艺发展，大大降低了各种污染的风险，提高了产品质量。

1.5 环境污染支原体 McGarrity通过一个模型发现了支原体在超净台内的细胞传代过程中的传播速度，活的支原体在超净台表面至少可存活4～6 d，且可成功复壮。传完被支原体污染的细胞后，再传干净的细胞，在6周后仍可检测出支原体阳性，表明支原体的传播容易和快速。

2 常用的支原体检测方法

2.1 一步法试剂盒检测法目前，多家公司推出Mycoplasma test kit(one step quick color)，一步法试剂盒的原理是环介导等温扩增技术(LAMP)，操作简单，加样量仅1 μL，通过变色来判定结果。曹元元等将实验室保存的牛支原体(M.bovis)分离株复苏培养物用培养法、PCR检测法和一步法三种方法进行鉴定,结果三种方法都可以鉴定培养物中支原体的存在；与培养法相比，一步法结果用肉眼就能清晰可见，周期短；与PCR检测法相比，一步法操作简单，周期短，但一步法的特异性较差，不能区分不同种属的支原体，因此应采用PCR与一步法相结合的方法以提高支原体检测的准确性[12]。

2.2 PCR法 PCR方法具有特异性强、灵敏度高、产率高、可有效缩短检测时间、更加便捷、重复性好、易自动化、对标本的纯度要求低等突出优点。但是，PCR还有易出现假阳性和假阴性结果、结果不具有肯定性、需多次摸索条件、要求操作熟练等缺点。秦明明等针对16S rRNA设计了5对引物，经大量试验摸索筛选出了一种可靠快速的实验室支原体PCR检测方法，序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGGCAGGA-3’,5’-TGCACCATCTGTC￣ACTCTGTTAACCTC-3’，目的片段为1021 bp，该PCR最低能够检出10 pg牛支原体基因组DNA以及浓度为100 CCU/mL的牛支原体培养物[13]。高广仁等建立了兽用生物制品中支原体污染的PCR检测方法，引物序列为：5’-GGGCCA￣AGAGGTTGTA-3’，5’-CCTTCGCCTATTGGTG-3’，目的片段约440 bp，该方法对大肠杆菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性；对鸡毒支原体、猪肺炎支原体、禽滑液支原体基因组DNA的检测灵敏度分别达到0.13 ng、0.88 ng、0.14 ng，与培养法的符合率达98.84%。以上结果表明，PCR方法适用于兽用生物制品生产的质量控制和疫苗质量检验的补充方法[14]。

2.3 分离培养法分离培养法使用固体培养基和液体培养基进行分离培养，大多数支原体可在固体培养基上出现特有的典型菌落，或在液体培养基中出现pH值变化，该方法准确、可靠，但培养时间较长，敏感性不够高，易受抗生素影响，且不能检出所有的支原体。目前，在《中国兽药典》中仍以培养法作为支原体的基本检测方法，但兽用生物制品企业亟待增加新的快速检测方法进行补充和完善。卞晓翠等发现PCR法和培养法检测支原体具有较好的互补性，应联合使用进行定期检测，以提高支原体的检出率[15]。

2.4 DNA结合荧光素染色支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰氏染色阴性。DNA结合荧光素染色法是利用荧光染料(bisben￣zimide, Hoechst 33258)结合到DNA的A-T富集区域(A-T含量达55%～80%)染色来实现支原体的检测。经染色后被支原体感染的细胞周围出现许多大小均一的荧光小点，证明有支原体存在。DNA荧光染色法适用于细胞和血清中的支原体检验，检验时间较短，操作简单，能对支原体污染的程度进行定量观察，但对仪器设备要求较高，仅适合于实验室研究[16]。

2.5 ELISA法某公司利用"ELISA抗体夹心法"的基本原理研制了支原体检测试剂盒，现已上市销售使用。该试剂盒具有结果准确、有效避免假阳性和假阴性、省时省力更经济、方法简单易操作、检测时间仅4～5 h、价格低廉、高灵敏度、高通量等特点。先将样品16S ribosomal RNA (rRNA)标上生物素标签和地高辛标签，再用预先包被在孔板上的链亲和素进行捕获，再加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛检测抗体，最后加入底物显色，通过比色法得出结果来判定有无支原体。

3 预防控制支原体的污染

3.1 原材料控制鸡胚、细胞、胰酶、血清等动物源性原材料均是兽用生物制品的重要生产材料，也是支原体赖以生存的基质，有研究表明有20多种支原体易污染鸡胚、细胞或血清，因此，在保证无菌的同时，使用前加强检验可有效阻止支原体污染。另外，在细胞培养方面，良好的个人卫生及操作规范是避免支原体污染的前提，再从制度上建立完善的检验体系，从种细胞或原代细胞到每个代次的细胞都进行严格的检验，保证所有代次的细胞均无支原体污染[17]。最后，对于新引进的种毒或种细胞必须先隔离培养，经检验合格后方可引进生产车间。

3.2 环境控制生产车间应定期清洁和消毒，并定期检测，保证环境参数均在可控范围内。生产流程中各个环节的细化，注重人、物、产品以及污物的进出路径，避免交叉污染。生产设备的消毒要彻底，根据生产用具和器械的特性进行相应的高压灭菌或消毒水浸泡，以确保消毒彻底。进入车间洁净区的所有物品均应经表面消毒或紫外照射后方可进入。

3.3 人员管理加强对所有人员的生产流程和操作流程的培训，要求所有人员严格按规定更衣，保证无裸露的皮肤暴露在环境中，对于有呼吸道疾病或皮肤病的人员禁止进入车间洁净区内。同时，要求所有人员的操作必须规范，杜绝任何小的不规范操作细节。例如操作过程中手离开操作台、进入操作台的器械或器皿未进行消毒、用手擦汗或接触到裸露的皮肤等均可能导致支原体污染。

3.4 消毒灭菌环节通过消毒灭菌可防止各种污染物和微生物的滋生，一方面要对生物制品生产过程中所用到的各种器具和物品进行消毒灭菌，通过无菌测试后方可使用，从源头上控制污染物的出现。另一方面，需注意消毒灭菌方式是否有效。比如高压锅或干热烤箱中堆积过多的物品造成加热不均，导致的未彻底灭菌。或者灭菌循环时间过短，特别是超过500 mL的液体，或者包含固体成分的溶液，或胶体物质(如琼脂、淀粉)等。所以，在消毒灭菌前必须考虑灭菌材料的尺寸、质量、性质和体积，方可保证消毒灭菌的效果。

3.5 合理利用抗生素抗生素对支原体污染具有一定的抑制作用，所以在生物制品生产过程中应合理利用以预防支原体污染现象的发生。但是支原体对一般抗生素不敏感，并具有一定的抗药性，所以应选择有效的抗生素，在控制好使用剂量的前提下，尽量做到既不不影响细胞的正常功能，又能较好地控制支原体污染。

4 支原体去除方法

4.1 配套试剂法目前，有多家公司宣称有配套的去除支原体试剂，均有以下特点：①毒性低：对细胞毒性小，不影响后续细胞实验；②稳定性强：-20 ℃能较长时间保存，并保持高效用；③操作简单：只需将试剂加至支原体污染的培养基中孵育即可；④起效快：最快3 d即可见效；⑤去除范围广：能去除实验室存在的多种支原体。但配套试剂法的具体效果还需验证。

4.2 抗生素法张丹丹等运用抗生素(plasmocin)进行了细胞支原体污染控制的研究，成功建立了山羊成纤维细胞培养过程中支原体污染的预防和去除平台[18]。较常用的抗生素有恩诺沙星、四环素、新霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、巴龙霉素等，如果长时间使用同一抗生素易产生耐药性。若污染了人支原体时，那么加入卡那霉素(1000 mg/mL)完全可以清除。一般对卡那霉素和四环素有抗药性的菌株，对庆大霉素和巴龙霉素抗药性也较大。除了以上抗生素，常推荐使用的还有泰霉素和诺霉素的复合物、喹诺酮的衍生物、Ciprobey(成分为环丙沙星)。多数学者建议联合使用几种抗菌素可以达到去除支原体的效果。