猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白GP3 调节Claudin 4促进其早期感染的分子机制研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是危害养猪业的重要病原之一。PRRSV 基因组具有高变异性，新的变异株不断出现，致使现有疫苗保护力不理想；加之缺乏有效药物，其致病机制也不完全清楚，使得该病更加难以防控。

紧密连接（TJ）是相邻细胞之间特化形成的连接结构，可调节细胞旁通透性，参与多种细胞信号转导途径。TJs 由40 多种不同的蛋白质组成，其中闭合蛋白（Occludin，OCLN）、密封蛋白（Claudins，CLDNs）和连接黏附分子是3 种主要类型的组成蛋白质。CLDN 是构成TJ 结构的主要蛋白，决定着水和离子的通透性。作为细胞之间紧密的物理屏障，CLDN 有助于抵御病毒感染，并被某些病毒劫持以促进其感染，例如丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、呼吸道合胞体病毒等。近期，《Journal of Virology》发表了“Porcine reproductive and respiratory syndrome virus structural protein GP3 regulates claudin 4 to facilitate the early stages of infection”的研究论文。该研究显示，PRRSV 感染的早期下调细胞中CLDN4的表达，后期则上调CLDN4 的表达，提示CLDN4在PRRSV 感染过程中可能起到非常重要的作用。进一步研究显示将CLDN4 敲低/敲除后能够显著促进PRRSV 的感染，而CLDN4 过表达则显著抑制PRRSV 的感染，这些结果表明CLDN4 可以抑制PRRSV 感染。通过构建CLDN4敲除和过表达的细胞系，通过抗体阻断、荧光定量PCR 和western blot等试验，发现CLDN4 可以抑制PRRSV 的吸附。免疫沉淀试验结果显示PRRSV 结构蛋白GP3 的C 末端与CLDN4 的小细胞外环结构域（ECL2）具有相互作用。人工合成的ECL2 多肽可以显著抑制病毒的吸附，从而抑制PRRSV 的感染，并呈现剂量依赖性。

为了进一步揭示PRRSV 感染早期下调CLDN4表达的机制，该研究克隆了CLDN4 的启动子区域及所有PRRSV 蛋白的真核表达质粒，利用双荧光素酶报告基因试验检测，结果显示结构蛋白GP3 可以下调CLDN4的启动子活性，同时通过western blot 鉴定了GP3 可以下调CLDN4 的表达。为了探究GP3 如何调控CLDN4基因的转录，通过western blot 等方法鉴定了PRRSV 感染可以下调CLDN4基因转录因子SP1的表达，敲低SP1 可以抑制CLDN4 的表达并促进病毒复制。进一步的研究显示GP3 蛋白可以提高SP1的泛素化水平，促进SP1 降解，从而下调CLDN4基因的转录，最终有利于PRRSV 吸附易感细胞，促进其感染。在此基础上提出了PRRSV 与CLDN4 相互作用的模型，即感染早期，少量PRRSV 与受体结合进入细胞，表达的GP3 使调控CLDN4基因转录的转录因子SP1 泛素化而被降解，从而下调CLDN4基因的转录和表达。少量表达的CLDN4 又促使大量的病毒颗粒进入细胞。

该研究结果阐述了PRRSV 的GP3 蛋白下调CLDN4 表达，促进PRRSV 早期感染细胞的机制；CLDN4 的ECL2 能够有效的抑制PRRSV 感染，为新的治疗性抗PRRS 药物的研制提供了新的思路。