硝基化合物作为反刍动物潜在产甲烷抑制剂的研究进展

郝增华，刘旭日*，张海静，连一苇

（1.邯郸职业技术学院，河北邯郸 056001；2.河北工程大学，河北邯郸 056038）

甲烷是排在二氧化碳之后的第二大温室气体，对全球变暖潜力比二氧化碳高25 倍以上。在畜牧业领域，反刍动物被认为是造成甲烷排放的主要原因。甲烷也是农业生产力的一个重要标志，因为它在反刍动物体内的产量约占饲料能量的2% ～15%，甲烷排放在一定程度上抑制了饲料向畜产品的转化，减少甲烷的排放旨在增加畜产品的产量。因此，减少反刍动物甲烷排放不仅有利于环境保护，而且有利于反刍动物的长期可持续发展。通过改变日粮来降低瘤胃甲烷的产生，如增加淀粉含量来优化日粮配方、饲料转化率高的遗传选择、饲料添加剂应用等。在这些研究中，许多饲料添加剂已被应用于反刍动物，以减少甲烷的排放，如莫能菌素，聚醚类离子载体型，已被应用于反刍动物的饲养实践，但它要么对寄主动物有毒，要么仅有短暂的抑制作用。在过去的几十年里，人们发现，硝基化合物包括硝基乙烷、2- 硝基醇、2- 硝基-1- 丙醇、3- 硝基-1- 丙醇、3- 硝基-1- 丙酸，抑制体外瘤胃甲烷的产生高达90%（Zhang 和Yang，2012）、体内抑制超过69%（Brown 等，2011）。这些硝基化合物主要指短链的一元脂肪族硝基化合物，许多瘤胃微生物能耐受这些硝基化合物中相对高浓度的硝基毒素。迄今为止，人们主要认为，硝基化合物在瘤胃甲烷生产中的抑制作用是替代电子受体，它们竞争性的降低还原物，对氢气和甲酸盐氧化产生抑制作用。本文综述了硝基化合物抑制甲烷产生的潜在作用，在生产实践中，硝基化合物对瘤胃甲烷生成的抑制作用高达69%。同时探讨了硝基化合物抑制瘤胃甲烷生成的可能机制和代谢过程。

1 硝基化合物及其在甲烷生产中的抑制作用

硝基化合物的分子公式为R-NO2，可视为碳氢化合物、醇类和脂肪酸的衍生物，其中硝基化合物中R 基团可以是烷基、羟基等，可分离一个或多个氢原子。根据不同烷基的存在，硝基化合物可分为脂肪族硝基化合物和芳香族硝基化合物；根据硝基的数目也被分为一元、二元和多元硝基化合物。但硝基化合物对瘤胃发酵产甲烷抑制作用的研究主要集中在短链一元脂肪族硝基化合物。

1.1 硝基乙烷 硝基乙烷（分子式：C2H5NO2）是一种无色油性液体，具有难闻的气味和刺激性，几乎不溶于水。据作者所知，脂肪族硝基乙烷没有生物来源，一般都是人工合成。近年来，对硝基乙烷对产甲烷的抑制作用广受关注，刺激了反刍动物甲烷排放研究。Brown 等（2011）证实了硝基乙烷对处理过的奶牛瘤胃微生物的抑制甲烷作用。硝基乙烷通过口服或瘘管直接给药的方式进入瘤胃已被证明可减少高达69% 的甲烷排放。但硝基乙烷在瘤胃中的抗甲烷作用机制尚不明确，有必要进行进一步研究，更全面地阐明其毒性、抑制活性和作用方式。

1.2 3- 硝 基-1- 丙 醇 3- 硝 基-1- 丙 醇（分子式：C3H7NO3）作为一种硝基氧化物，其在瘤胃甲烷减排中的作用被广泛研究。Martinez-Fernandez 等（2014）发现，100 mg/d 3- 硝基-1-丙醇可以使泌乳奶牛的甲烷产量降低16%。此外，Hristov 等（2015）发现，在饲料中添加40 ～80 mg/kg 3- 硝基-1- 丙醇可以使高产奶牛甲烷排放降低30%，而对奶牛的生产性能无负面影响。目前，3- 硝基-1- 丙醇是一种有效的甲烷抑制剂，专门针对甲基还原酶，可有效抑制甲烷生成（Hristov 等，2015）。

1.3 其他硝基化合物 一般来说，像2- 硝基乙醇（分 子 式：C2H5NO3）、2- 硝 基-1- 丙 醇（分 子式：C3H7NO3）这样的硝基醇和3- 硝基-1- 丙酸（分子式：C3H5NO4）这样的硝基酸都是短链脂肪族硝基化合物。Anderson 等（2006）发现，每日口服120 mg/kg2- 硝基-1- 丙醇可以使甲烷产量降低37%。2- 硝基醇是一种低沸点的淡黄色液体、脂肪族硝基醇，具有直链碳架，包含一个硝基和醇官能团。目前关于2- 硝基醇的体内动物试验未见报道，但其作用效果与硝基乙烷类似（Anderson等，2006）。

2 硝基化合物抑制甲烷生成的作用模式

反刍动物的产甲烷活性释放了产甲烷菌生存所需的能量，维持了较低的氢气压力，为瘤胃发酵创造良好环境。但大多数传统的抗甲烷策略都抑制了氢气的有益氧化，导致氢气积累。此外，一些产甲烷抑制剂也有副作用，降低了某些消化过程和微生物代谢物的产量，同时降低了乙酸产量，增加了可发酵酸含量，尤其是丙酸。由于瘤胃生态系统具有适应紊乱的能力，一些产甲烷抑制剂的作用往往是暂时的。但硝基化合物作为甲烷抑制剂时，在瘤胃或体外培养中对挥发性脂肪酸的产量及饲料利用效率的影响较小（Anderson等，2006）。研究发现，硝基化合物对甲烷生成的抑制并没有显著增加氢气的积累。迄今为止，人们普遍认为硝基化合物可能通过抑制氢气和甲酸盐氧化来抑制甲烷的生成，作为电子的替代受体，竞争性地消耗还原当量（其中产甲烷阶段：甲烷菌利用CO2、H2产生CH4，产甲烷反应：HCOOH+H2O → CH4+HCO3-4H2+HCO3-+H+→ CH4+3H2O）。因此，硝基化合物被认为具有抗甲烷的潜力，并最终可能促进开发商业上可行的干预措施，以减少瘤胃甲烷的生成。

（1）瘤胃甲烷抑制与挥发性脂肪酸生成的关系，甲烷抑制剂会导致丙酸盐代偿性增加，同时乙酸盐累积量减少，导致挥发性脂肪酸总量下降。但与其他甲烷抑制作用方式不同的是，硝基化合物对瘤胃微生物菌群产生的摩尔比例影响不大（Anderson 等，2006），其研究表明，硝基乙烷不会引起瘤胃挥发性脂肪酸浓度的显著变化（乙酸、丁酸和挥发性脂肪酸总量）。另一种可能是，微生物种群与甲烷生成过程中保留下来电子结合将硝基化合物还原为各自的胺。由于细菌代谢率随发酵时间的增加而增加，表明硝基代谢的微生物发生了富集（Gutierrez-Banuelos 等，2008），这可能为瘤胃功能作出积极作用，因为这些微生物种群可以用于减少硝基一部分电子的消耗。

（2）氢积累瘤胃中氢的浓度大约是1μM，氢气在瘤胃中的积累传统上是不可取的，因为它抑制还原核苷酸的再氧化，降低微生物细胞产量和发酵效率（Miller，1995）。甲烷残留降低能维持瘤胃微生物种群在瘤胃发酵过程中积累还原性物质的能力。硝基乙烷被认为是瘤胃细菌的末端电子受体，因此，有可能消耗掉以甲烷生产为代价的还原物质。与大多数瘤胃甲烷生成抑制剂不同，硝基化合物对甲烷生成的抑制并没有显著增加瘤胃微生物对氢气的积累。Anderson 等（2003）研究表明，与对照组相比，硝基化合物组至少降低57% ～94% 的甲烷生产量，表明微生物种间的氢转移，即减少在发酵过程中等量的消耗（Miller，1995）。在这些含氮培养基中，氢气积累量低与甲酸脱氢酶/ 甲酸氢裂解酶活性可能抑制氢气产生是一致的，因为在没有甲烷产生的情况下，氢气可能会积累到更高的浓度（Anderson 等，2003）。此外，有可能是由于氢气浓度超过抑制氢化酶催化生成氢气的浓度，从而阻止了含氮培养基中氢气的积累（Miller，1995），而氢化酶也是可逆酶，可以催化氢气的生成或氧化，也可能是硝基化合物抑制了氢气生成氢酶的活性。

（3）甲酸盐氧化的抑制和铁氧化还原蛋白相关氢化酶活力，一些瘤胃产甲烷菌通过甲酸脱氢酶的微生物活性直接氧化甲酸盐，据估计，瘤胃中甲烷产生的18% 都是来自甲酸盐，Anderson 等（2008）指出，甲烷产量减少97%，甲酸浓度维持在118%。此外，2- 硝基醇通过铁氧化还原蛋白抑制克氏梭菌铁氧化还原蛋白相关氢化酶活性，但目前还不清楚2- 硝基醇或其他硝基化合物是否同样抑制不利用铁氧化还原蛋白作为电子载体的产甲烷菌的电子载体连接活性（Deppenmeier，2002）。

（4）McAllister 等（1996）报道了瘤胃生态系统对各种甲烷抑制化合物的适应性。在此类研究中，硝基乙烷处理后第5 天，微生物产甲烷活性减少，表明硝基化合物对瘤胃微生物群具有潜在的适应性。瘤胃对这些硝基化合物的适应可能是由于体内硝基化合物还原细菌的富集，这种细菌能消耗抑制剂的有效浓度。硝基化合物还原菌数量的增加可以加速瘤胃中硝基化合物及其相关抗甲烷活性。如Anderson 等（2006）发现，硝基化合物的抗甲烷作用（特别是在低剂量时）似乎是短暂的，Brown 等（2011）研究表明，没有证据可以表明瘤胃微生物种群对硝基乙烷有适应性反应，因为与第1 天相比，试验第4 天和第8 天的甲烷排放量都减少约15%。因此，后续研究需要在不同类型日粮条件下充分评估瘤胃微生物种群的潜力，以适应硝基化合物的处理。

一般来说，似乎没有任何障碍可以限制使用硝基化合物作为甲烷生成抑制剂，因为挥发性脂肪酸的生成和发酵效率没有受到影响，同时体内研究也没有发现氢气的积累。此外，辅酶M 甲基转移酶和甲基辅酶M- 还原酶分别是产甲烷过程中负责甲基基团转移和氢- 电子转移的两个关键酶。但目前还不清楚硝基化合物在抑制瘤胃甲烷生成过程中如何影响这些辅酶的活性。

3 瘤胃中硝基化合物毒性及微生物对硝基化合物的代谢

3.1 硝基化合物毒性 硝基化合物抑制甲烷生成的作用对环境具有重要意义。尽管只有10% ～20% 的微生物种群暴露于硝基化合物中，可能受到瘤胃中给定浓度的抑制，但大多数瘤胃微生物已能耐受相对高浓度的硝基毒素（Anderson 等，1993）。在反刍动物上连续16 d 给予160 mg/kg 体重的硝基乙烷没有发现显著的毒性迹象。但James 等（1980）发现，静脉注射30或52 mg/kg 3- 硝基丙醇达到了牛和羊的致死剂量。因反刍动物对高浓度硝基毒素具有耐受性，使硝基化合物作为抗甲烷抑制剂在实际应用中成为可能。

3.2 瘤胃微生物对硝基化合物的代谢 反刍动物瘤胃内的多种微生物可以消除由硝基化合物产生的毒性，包括瘤胃拟杆菌属、脱硫弧菌属、瘤胃硒单胞菌、及梭菌、粪球菌、乳酸菌和消化性链球菌，这些微生物可能主要是减少硝基甲烷、3-硝基丙醇、氨基乙烷、氨基乙醇的毒性（Anderson等，1993）。到目前为止，只有一种名为D. 脱毒剂的代谢细菌（革兰氏阳性，特异性呼吸厌氧菌，能代谢硝基化合物）可以在反刍动物逐渐适应硝基毒素的耐受性过程中起重要作用（Anderson 等，2006）。

瘤胃氮化合物代谢速率受多种因素的影响。补充含有硝酸盐或硝基乙烷的低毒性类似物硝基丙醇可提高瘤胃硝基丙醇代谢率（Majak，1992），研究发现，当放牧牛群采食糖蜜时硝基丙醇代谢率增加24%。同时大量还原剂和发酵产物的供应（包括氢、甲酸盐、乳酸盐及其他几种底物）将导致瘤胃硝酸盐和亚硝酸盐的快速还原，这意味着不同日粮对3- 硝基丙醇代谢的影响同样表现为提供大量所需的还原物质。但在某些情况下，瘤胃内的硝基毒素代谢可能受到其他必要底物或营养物质有效性的限制，这还需要进一步研究。

4 结论

甲烷的排放主要来自反刍动物，是全球变暖的一个重要因素。减少反刍动物的甲烷排放迫在眉睫。本文综述了近年来硝基化合物作为瘤胃产甲烷有效抑制剂的研究进展，硝基化合物对瘤胃发酵的抑制作用较好，对瘤胃发酵的危害较小。但瘤胃生成甲烷涉及许多生物学过程，这些过程有许多酶和辅酶参与。但目前还不清楚硝基化合物影响甲基和氢- 电子转移酶活性的作用机理，需要进一步探讨硝基化合物的抑制作用模式。