羊梨形虫分子分类遗传标记的研究进展

郝桂英

（西昌学院 动物科学学院，四川 西昌 615013）

羊梨形虫（piroplasms）隶属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoea）、梨形虫亚纲（Piroplasmia）、巴贝斯科（Babesiidae）巴贝斯属（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒属（Theileria）[1]。目前，国内外已报道感染羊的巴贝斯虫主要有莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）、绵羊巴贝斯虫（B. ovis）、粗糙巴贝斯虫（B.crassa）、叶状巴贝斯虫（B.foliata）、泰氏巴贝斯虫（B. taylori）和新疆巴贝斯虫未定种（Babesia sp. Xinjiang）[2]；泰勒虫有吕氏泰勒虫（Theileria luwenshuin）、尤氏泰勒虫（T. uilenbergi）、绵羊泰勒虫（T. ovis）、莱氏泰勒虫（T. lestoquardi）、分离泰勒虫（T.separata）和隐藏泰勒虫（T.recondita）[3-7]。我国已报道了莫氏巴贝斯虫、新疆巴贝斯虫未定种（介于莫氏巴贝斯虫和粗糙巴贝斯虫之间）、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫[8-9]。本文就羊梨形虫分子分类遗传标记研究的最新进展进行综述。

1 核糖体DNA 序列

核糖体DNA 是一类中度重复序列，以串联多拷贝的形式存在于细胞核内染色体DNA 中。每个重复单位由3 种核糖体基因编码区（18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA）、内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）和非转录间隔区（non-transcribed spacer，NTS）组成。

1.1 核糖体小亚基RNA（18S rRNA）基因 近年来，18S rRNA 基因作为分子标记在羊梨形虫分子分类、遗传进化研究中得到了广泛应用[10]。Schnittger等基于18S rRNA 基因序列对72 个分离自世界各地绵羊和山羊的梨形虫进行了系统发育关系研究，发现泰勒虫的进化史较巴贝斯虫短，且泰勒虫各个虫株间的变异性较低[5]。

Liu 等基于18S rRNA 基因片段绘制的系统发育树显示巴贝斯虫马当株、天祝株、临潭株、宁县株、河北株和辽宁株均聚在莫氏巴贝斯虫分支，同源性为88.2%～99.9%，而新疆巴贝斯虫未定种单独为一支，与已知羊巴贝斯虫和粗糙巴贝斯虫的同源性为79.7%～81.2%，与羊巴贝斯虫中国株的同源性低于86.6%[11]。因此，Liu等提出我国至少存在莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种2 种感染羊的巴贝斯虫[11]。

马米玲等报道羊源巴贝斯虫未定种敦煌株与羊巴贝斯虫马当株、天祝株、临潭株、宁县株、河北株、辽宁株和新疆株18S rRNA 基因序列的同源性为84.9%～99.8%，其中与辽宁株的同源性最低，与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高。基于18S rRNA 基因序列绘制的系统发育树显示巴贝斯虫未定种敦煌株与新疆巴贝斯虫未定种和分离自南非长颈鹿的巴贝斯虫未定种位于同一支[12]。

李有全等基于18S rRNA 基因序列构建的系统发育树发现，永靖、张家川、临潭和龙德的尤氏泰勒虫聚在同一支。新疆的绵羊泰勒虫与法国、西班牙、土耳其的绵羊泰勒虫先聚为一支，然后再与苏丹的绵羊泰勒虫聚类。5 个大悟的吕氏泰勒虫聚在同一小支，与宁县的吕氏泰勒虫亲缘关系最近；榆中的吕氏泰勒虫与渭源2 号、青海、马当的吕氏泰勒虫聚类；但渭源4号吕氏泰勒虫单独为一支，与其他吕氏泰勒虫的亲缘关系较远。因此，不同地方的吕氏泰勒虫间的差异比不同地方尤氏泰勒虫间的差异大，渭源的吕氏泰勒虫可能存在不同的基因型[13]。

Li 等报道采集自大悟山羊、随州山羊、睢县山羊、嵩县绵羊和洛阳绵羊的29 个羊泰勒虫18S rRNA基因序列的同源性为99.7%～100%，与渭源2 号、麻城、浙江99 号、宁夏、青海和榆中2 号吕氏泰勒虫的同源性均为99.7%。基于18S rRNA 基因序列构建的系统发育树显示吕氏泰勒虫与水牛泰勒虫/瑟氏泰勒虫（T. buffeli/T. sergenti）亲缘关系最近，位于不引起淋巴组织增生的泰勒虫分支上，而引起淋巴组织增生的泰勒虫如环形泰勒虫、小泰勒虫和莱氏泰勒虫等聚在另一支上[14]。

田万年等基于18S rRNA 基因序列绘制的系统发育树显示吉林的吕氏泰勒虫与青海的吕氏泰勒虫亲缘关系最近，与榆中、渭源、马当、宁县和大悟的吕氏泰勒虫亲缘关系较远，与青海的尤氏泰勒虫、临潭的尤氏泰勒虫、新疆的绵羊泰勒虫、土耳其的绵羊泰勒虫亲缘关系更远[15]。

于正清等报道陕南的吕氏泰勒虫18S rRNA 基因序列（1 275 bp）与浙江99 号的吕氏泰勒虫同源性为99%。基于18S rRNA 基因片段构建的NJ 树发现，2个陕南的吕氏泰勒虫与浙江99 号的吕氏泰勒虫、吕氏泰勒虫（AF081136）聚在同一支上[16]。

Zhou 等报道分离自土耳其绵羊的5 个绵羊巴贝斯虫18S rRNA 基因序列间的同源性为98.54%～99.82%，与已报道的土耳其、突尼斯、西班牙和葡萄牙的绵羊巴贝斯虫的同源性也为98.54%～99.82%。基于18S rRNA 基因序列构建的系统发育树显示土耳其的绵羊巴贝斯虫（AY260178）未与其他地方的绵羊巴贝斯虫聚在同一支上，推测土耳其的绵羊巴贝斯虫可能存在不同的基因型；分离自土耳其绵羊的5 个绵羊泰勒虫18S rRNA 基因序列的同源性为99.23%～99.81%，与已报道的土耳其的绵羊泰勒虫的同源性为99.23%～100%，与坦桑尼亚的绵羊泰勒虫的同源性为99.23%～99.81%，与中国、突尼斯、伊朗、西班牙、苏丹的绵羊泰勒虫的同源性为99.23%～100%。基于18S rRNA基因序列绘制的系统发育树发现，土耳其的绵羊泰勒虫可能存在两种基因型[17]。

Ozubek 等对122 份土耳其山羊血样进行巴贝斯虫18S rRNA 基因高变异区的PCR扩增，从其中7 份血样中测序获得两个新序列（KU714605、KU714606），两者的同源性为99.64%，与绵羊巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫和粗糙巴贝斯虫的同源性分别为90.9%、93.5%和93.4%，与近几年中国报道的巴贝斯虫基因型和希腊绵羊的B.lengau同源性为91%～93%，与加拿大麋鹿的B. odocoilei（KC460321）、荷兰森林驯鹿的Babesia sp.EU1（GQ888709）和土耳其母牛的分歧巴贝斯虫（B.divergens，KP745627）同源性最高（96%～97%）。基于18S rRNA基因序列构建的系统发育树显示两个土耳其的巴贝斯虫与B.odocoilei、Babesia sp.EU1 和分歧巴贝斯虫聚在同一支上。因此，Ozubek 等推测寄生于土耳其山羊的巴贝斯虫可能是一个新种[18]。

钟维等报道壤塘和红原藏绵羊的吕氏泰勒虫18S rRNA 基因序列的同源性为100%，与小金的吕氏泰勒虫同源性为99.4%，与青海、宁夏的吕氏泰勒虫同源性为97.8%～99.8%。构建的系统发育树显示藏绵羊感染的吕氏泰勒虫与国内外报道的吕氏泰勒虫均处于同一分支，且与青海的吕氏泰勒虫亲缘关系最近[19]。

1.2 ITS ITS 是 核 糖 体RNA（rRNA）上 介 于18S rRNA 和28S rRNA 基因之间的内转录间隔区，包含位于18S rRNA 和5.8S rRNA 之间的核糖体RNA 第一内转录间隔区（ITS1）和位于5.8S rRNA 和28S rRNA 之间的核糖体RNA 第二内转录间隔区（ITS2）两段序列，有时也将ITS1、5.8S rRNA 和ITS2 统称为ITS 区。

由于ITS 具有进化速度快、种内变异小而种间变异大、长度适中、有足够的遗传信息等优点，因此，ITS 序列已越来越多地用于梨形虫分类学研究。Aktas等克隆并测序了16 个牛、羊泰勒虫的ITS 区，发现ITS1 基因的序列长度和碱基变异均比ITS2变异更大[20]。

莫氏巴贝斯虫宁县株、马当株、天祝株、临潭株和河北株的ITS1、5.8S rRNA、ITS2 序列同源性分别为71.2%～92.3%、98.7%～100.0%和65.7%～92.1%，而喀什的羊巴贝斯虫与以上5 个莫氏巴贝斯虫分离株的ITS1、5.8S rRNA、ITS2 序列的同源性分别为2.5%～2.8%、91.9%～93.7%和9.0%～12.2%；基于ITS全序列构建的系统发育树显示喀什的羊巴贝斯虫单独为一支，而中国其他5 个莫氏巴贝斯虫分离株聚在同一支，且又被分为两个小支：一支是低致病力的莫氏巴贝斯虫临潭株[21]、马当株和天祝株，另一支是高致病力的莫氏巴贝斯虫宁县株[22]和河北株，进一步证实我国至少存在2 种感染羊的巴贝斯虫[23]。

Tian 等报道分离自新疆绵羊的Theileria sp. OT3与西班牙的Theileria sp. OT3 18S rRNA 基因序列（DQ866839）的同源性为99%（有2 个碱基差异）；基于ITS 全序列构建的系统发育树显示：新疆的Theileria sp.OT3 单独为一支，先与尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫聚类形成一支，再与绵羊泰勒虫聚类。因此，新疆的Theileria sp.OT3 与尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的亲缘关系更近[24]。

1.3 核糖体大亚基RNA（28S rRNA）基因 Gou 等报道莫氏巴贝斯虫临潭株、宁县株、天祝株、河北株和新疆巴贝斯虫未定种的28S rRNA 和18S rRNA 基因序列的同源性分别为85.8%～99.9%和93.5%～99.2%，因此28S rRNA 基因比18S rRNA 基因有更多的遗传信息；基于28S rRNA 和28S rRNA+18S rRNA 基因联合序列构建的系统发育树显示莫氏巴贝斯虫临潭株与天祝株首先聚类，再与河北株聚类，最后与宁县株聚类。而基于18S rRNA 基因序列构建的系统发育树是莫氏巴贝斯虫临潭株与宁县株首先聚类，再与天祝株聚类，最后与河北株聚类。前两者构建的系统发育树比18S rRNA 单基因序列构建的系统发育树更合理，能较好地阐明莫氏巴贝斯虫的系统发育。因此，28S rRNA 基因可作为巴贝斯虫系统发育研究的遗传标记[25]。

吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫虽然有相似的形态、宿主、媒介蜱、致病力和分布，但基于28S rRNA 基因全序列和28S rRNA 基因D2-D3 片段绘制的系统发育树再次证实吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫是两个不同的种。泰勒虫28S rRNA 基因全序列和D2-D3 片段比18S rRNA 基因序列有更多的种内变异位点，因此，28S rRNA 基因是进行泰勒虫系统发育分析的一个有用遗传标记，D2～D3 片段可代替28S rRNA 基因全序列用于泰勒虫种类鉴定，可能是泰勒虫分子鉴定的一个理想DNA 条形码[26]。

2 线粒体遗传标记

2.1 线粒体基因组的特征 目前，在羊梨形虫中仅见羊巴贝斯虫临潭株（Bl）和羊巴贝斯虫新疆株（Bx）线粒体基因组全序列的报道[27]，其长度分别为5 790 bp 和6 020 bp，与已报道的牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、东方巴贝斯虫、马巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫（线粒体基因组长度为5 847 bp～6 005 bp）及环形泰勒虫、东方泰勒虫和小泰勒虫（线粒体基因组长度为5 905 bp～5 957 bp）线粒体基因组大小相似，但小于田鼠巴贝斯虫、B. rodhaini 和马泰勒虫的线粒体基因组（线粒体基因组长度为6 929 bp～11 109 bp）。Bl 和Bx 的线粒体基因组由细胞色素C 氧化酶亚基I 基因（cox1）、细胞色素C 氧化酶亚基III 基因（cox3）和细胞色素b 基因（cob）3 个蛋白质编码基因及5 个或6 个大亚基rRNA 基因（命名为L1～L6）组成，无tRNA基因。蛋白质编码基因的转录方向和顺序与牛巴贝斯虫（EU075182、AB499088）、双芽巴贝斯虫（AB499085）、东方巴贝斯虫（KF218819）、马巴贝斯虫（AB499086）、吉氏巴贝斯虫（AB499087）和小泰勒虫（AB499089）一致，但与田鼠巴贝斯虫（AB624353）、B.rodhaini（AB624357）、东方巴贝斯虫（AB499090）和马泰勒虫（AB499091）明显不同。

Bl 和Bx 线粒体基因组的核苷酸差异为86.8%，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、东方巴贝斯虫、马巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫、田鼠巴贝斯虫和B. rodhaini 相比，核苷酸差异为6.9%～78.5%。这9 个虫种cox1、cox3 和cob 基因的核苷酸差异分别为10.3%～36.9%、8.9%～57.6%和8.9%～50.9%。相反，氨基酸序列的差异和分歧分别为5.9%～37.3%和17.9%～75.5%。

在蛋白质编码基因中，cox1 基因序列相对保守，cob 基因序列具有中等程度的变异，而cox3 基因序列有较大的序列。因此，线粒体基因组某些区域可作为系统发育学或种群遗传学研究的标记基因。

2.2 cox1 基因 cox1 作为线粒体基因组的重要组成部分，具有适度的序列变异，使其在任何分类阶元中都可使用。与18S rRNA 基因序列相比，cox1 基因序列含有更多的变异位点，可作为物种分子分类的首选基因。因此，基于cox1 基因序列的巴贝斯虫/泰勒虫分子分类能够更清楚地反映出巴贝斯虫/泰勒虫种类、种间的进化关系，不同宿主来源的巴贝斯虫/泰勒虫之间、同一种巴贝斯虫/泰勒虫不同地方株间的关系[28-29]。

苟惠天等报道莫氏巴贝斯虫临潭株、宁县株、天祝株、河北株与新疆巴贝斯虫未定种cox1 基因片段（976 bp）的同源性为88.2%～100%，18S rRNA 基因片段（1 680 bp～1 715 bp）的同源性为93.5%～99.2%。基于两个基因的系统发育树说明我国莫氏巴贝斯虫不同地方株间可能存在亚种关系，但新疆巴贝斯虫未定种的分类地位在基于cox1 基因的分类中更合理[30]。

2.3 cox3 基因 基于cox3 基因部分序列（552 bp）绘制的系统发育树显示莫氏巴贝斯虫宁县株未与临潭株/天祝株聚在同一支上，与基于cob 基因的系统发育分析结果相似，而与18S rRNA 的系统发育结果不一致。18S rRNA基因和cox3基因联合绘制的系统发育树提高了莫氏巴贝斯虫系统发育关系的可靠性。莫氏巴贝斯虫分离株的致病力差异和血清交叉反应有助于解释莫氏巴贝斯虫分离株的分子差异。与18S rRNA 和cob 基因相比，cox3 基因种内差异显著[31]。

2.4 cob 基因 Tian 等报道6 种寄生于牛、羊的巴贝斯虫cob 部分序列（550 bp）的核苷酸变异率为1.6%～30.8%。相对于cob 部分序列和ITS，18S rRNA能够可靠地区分某些巴贝斯虫虫种间较深的分支，而cob 基因部分序列在识别某些巴贝斯虫不同地方株方面优于18S rRNA 和ITS[32]。

3 其它基因

3.1 梨形虫主要表面膜蛋白（Major piroplasm surface proteins, MPSP）基因 MPSP 为泰勒虫特有，是泰勒虫感染红细胞阶段虫体分泌的一种保守性较强的糖蛋白，在裂殖体和子孢子阶段都有表达[33]，可用作研究泰勒虫分子分类和系统发育的分子标记[34-35]。根据MPSP 基因将瑟氏泰勒虫划分为I（Ikeda）、C（Chitose）、B（Buffeli）和Thai 四种亚型[32]，东方泰勒虫划分为11 种基因型（1-8 型和N1-N3 型）[35]。羊梨形虫仅见吕氏泰勒虫MPSP的报道，2个陕西的羊吕氏泰勒虫与宁县的吕氏泰勒虫MPSP 基因序列的同源性分别为100%和99%[36]。

3.2 40S 核糖体蛋白S8（RPS8）基因 基于RPS8基因序列（561 bp）绘制的系统发育树将莫氏巴贝斯虫分成宁县株和临潭株/天祝株两个小分枝[37]。Tian等认为RPS8 基因是一种有用的、新颖的遗传标记，它在种内变异较小，而种间变异较大，可用于巴贝斯虫种类鉴定和系统发育研究[37]。

3.3 热休克蛋白90（HSP90）基因 Guan 等报道莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株、宁县株和河北株HSP90 基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均大于93.2%，其中临潭株和天祝株的同源性为99.4%，宁县株和河北株的同源性为98.8%，四者与巴贝斯虫未定种新疆株的同源性均低于80%。基于HSP90 基因序列绘制的系统发育树将莫氏巴贝斯虫分成临潭株/天祝株和宁县株/河北株两个小分枝[38]。

3.4 血小板反应相关黏附蛋白（Thrombospondinrelated adhesive protein，TRAP）基因 TRAP 是由多基因编码的一种Ⅰ型跨膜蛋白，属于微线体蛋白，由胞外的血小板结合蛋白样结构域和/或整合素A样结构域、跨膜区和胞质尾部结构域组成。在多种顶复门原虫入侵宿主过程中起重要作用，具有种/属和发育阶段特异性[39]。何欣等报道莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株、天祝株、临潭株和巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株的TRAP 基因开放阅读框大小分别为2 286 bp、2 142 bp、2 100 bp 和1 944 bp，分别含有3 个、4 个、4 个和5 个内含子。莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99.9%，莫氏巴贝斯虫天祝株和临潭株的同源性分别为99.8%和99.9%，巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株的同源性均为100%；莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55.4%～56.1%和43.6%～46.9%，而莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株与莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株的同源性分别为74.0%～74.6%和59.1%。即组内核苷酸同源性为99.8%～100%，而组间同源性为43.6%～74.6%。基于TRAP基因序列构建的系统发育树显示，我国6 株羊巴贝斯虫被分为莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株两大枝，而莫氏巴贝斯虫又被分成宁县株/河北株和天祝株/临潭株两个小枝。研究结果表明6 株羊巴贝斯虫TRAP 基因结构存在差异，但其蛋白特征性的结构域较为保守。研究结果再次证实我国分离到两种羊巴贝斯虫，且莫氏巴贝斯虫可能存在两个亚种[40-42]。

3.5 棒状体相关蛋白-1（Rhoptry-associated protein-1，RAP-1）基因 RAP-1 位于巴贝斯虫裂殖子顶端，在子孢子、裂殖子阶段均有表达。Niu 等报道羊巴贝斯虫天祝株、临潭株和宁县株RAP-1 基因、18S rRNA 基因序列的核苷酸同源性分别为99.9%和98.7%，与巴贝斯虫河北株的核苷酸同源性分别为78%和98.7%。基于RAP-1 基因序列绘制的系统发育树显示，巴贝斯虫天祝株、临潭株和宁县株聚为一支，而巴贝斯虫河北株单独为一支[43]。

Niu 等报道18 个采集自海南、广东、广西、云南、重庆、四川、湖北、陕西、甘肃、河北、辽宁、内蒙古绵羊和山羊的巴贝斯虫未定种的RAP-1a基因拷贝的N 端保守区域（162 nt～670 nt）的部分序列（507 bp）同源性为100%[44]。Niu 等报道采集自河南、湖北、新疆、内蒙古、海南、甘肃绵羊血液的巴贝斯虫RAP-1b基因3'端的536 bp 序列与巴贝斯虫BQ1（临潭和宁县）同源性为100%，构建的系统发育树分别聚在巴贝斯虫BQ1（临潭和宁县）/巴贝斯虫天祝株分支和巴贝斯虫河北株分支两支上[45]。因此，近缘种的RAP-1 基因序列比18S rRNA 基因序列更保守[44]。

徐建林等报道莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株、莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株、羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株棒状体颈部蛋白RON2 基因ORF 的分别为4 044 bp、4 047 bp 和4 029 bp，核苷酸和氨基酸序列相似性分别为67.0%～67.4%和69.2%～69.3%，莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株和莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株间间的相似性分别为92.8%～92.9%和91.1%～91.2%。系统发生树上羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫分别位于2 大支，莫氏巴贝斯虫又被分为2小支[46]。

4 小结与展望

越来越多的研究显示18S rRNA 基因作为分类基因在科或更高阶元的研究时显示出一定优势，但在区分亲缘关系很近的物种（属以下）时，其结果不甚理想。线粒体cox1 基因可能适合种类分子鉴定和/或分化，而cox3 和cob 可能适合识别巴贝斯虫/泰勒虫种内不同株。以莫氏巴贝斯虫为例，不同莫氏巴贝斯虫地方分离株在使用不同基因进行遗传进化分析时得到的结果不一致。如基于18S rRNA和28S rRNA基因序列构建的系统发育树莫氏巴贝斯虫聚在同一枝，且未形成明显的聚类小分枝；基于ITS、cox1、cox3、cob、RPS8、HSP90 和TRAP 基因序列构建的系统发育树将其分成河北株/宁县株和临潭株/天祝株两个小枝；基于RAP-1 基因序列构建的系统发育树将其分成宁县株/临潭株/天祝株和河北株两个小枝。因此，选取多个分子标记共同进行分析，对更深入地了解羊梨形虫的分子分类、种群遗传进化、系统发生历史有一定的促进作用，并有利于发现潜在的亚种。

综上所述，羊梨形虫的分子分类学研究已取得了一定的进展。相信随着分子遗传学研究的不断深入，羊梨形虫种类分类学研究和遗传变异研究会取得更大突破。