水产口服DNA疫苗研究进展

翁宏飚，沈卫锋，牛宝龙

(浙江省农业科学院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

近年来，我国水产行业发展迅猛，水产养殖产量多年居世界首位。随着水产养殖集约化水平的不断提高，养殖水环境持续恶化，水产病害频发。据统计，全球每年因水产病害造成的损失约占养殖总产量的10%，损失总额超过100亿美元[1]。我国每年水产病害发病率达50%以上，疫病已成为制约水产养殖业发展的重要因素。鱼类疾病的防控措施主要有药物防控、免疫预防、生态与综合防控等手段。长期以来，我国水产疫病的控制主要依靠使用各种抗生素和化学药物，但化学投入品的长期使用不仅会增加病原菌的耐药性，同时也破坏了鱼体及养殖环境微生态，导致水产品药物残留，严重制约着我国水产行业发展[2]。

免疫预防是控制水产动物病害较为有效的措施，通过刺激水产动物免疫系统，提高其抗病能力，从而降低疾病发生率，具有无残留、无污染、不易引起耐药性等特点。自1942年首次研制出防控硬头鳟疫病的灭活口服疫苗，已研制出灭活菌苗、减毒菌苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗等多种水产疫苗。水产疫苗的接种方式主要包括注射、浸泡(喷雾)和口服3种，不同接种方式对免疫保护的诱导有重要影响，在实用性、成本与效益方面均有各自的优点。本文就水产口服DNA疫苗的研究现状进行综述，旨为研究安全、高效的新型口服疫苗提供一定的参考信息。

1 免疫机制

1.1 鱼类口服疫苗免疫机制

与哺乳动物相比，研究者对硬骨鱼类的口服免疫机制尚未完全了解。组织学观察口服插管给药后的荧光微粒在斑马鱼肠道中的分布发现，进入肠道的微粒可被肠道快速吸收，并转移到肝脏和胰脏的巨噬细胞中[3]。硬骨鱼后肠上皮细胞内存在大量巨噬细胞和与免疫相关的B细胞、T细胞，消化道壁附着的黏液中含有多种凝集素、黏蛋白、抗菌肽、毒素、免疫球蛋白等免疫相关因子[4]。经口服给药处理后，可在草鱼、虹鳟等硬骨鱼肠道黏膜组织中检测到特异性抗体[5]，说明口服抗原可诱导硬骨鱼的免疫反应。免疫诱导后，硬骨鱼可以产生IgM、IgD、IgT等多种免疫球蛋白[6]，其中IgT为硬骨鱼特有的免疫球蛋白类型[7]。

多聚免疫球蛋白是黏膜防御的主要分子，其受体(pIgR)负责转运免疫球蛋白分子。哺乳动物中，pIgR主要在黏膜上皮细胞及肝细胞中表达，由胞质区、跨膜区、胞外区及5个类免疫球蛋白域组成。免疫球蛋白与其受体结合后形成复合体，通过转胞吞作用运输，在肠腔中或细胞内中和病原体，并在机体免疫激活及免疫耐受诱导等方面有主要作用[8]。已有研究从河豚、虹鳟、大西洋鲑、牙鲆、斑马鱼、草鱼等硬骨鱼中分离获得pIgR。与哺乳动物源受体序列相比，硬骨鱼的pIgR少了3个类互补-决定域环和第5个类免疫球蛋白域(ILD5)[6]，这些截短受体可与IgT和IgM结合而发挥作用[9]。另外，在硬骨鱼基因组中发现许多聚合物免疫球蛋白受体类似物(PIGRL)基因，这些基因可能在黏膜免疫中有不同的功能。Kortum等[10]研究发现，斑马鱼2号染色体上包含1个由29个PIGRL基因组成的多基因簇，其中10个PIGRL基因编码的蛋白可抑制膜结合受体。不同于聚合物免疫球蛋白(pIgR)与免疫球蛋白结合，PIGRL蛋白只与卵磷脂结合。细菌攻毒后可以诱导PIGRL基因表达上调，而病毒侵染后则抑制基因表达。大豆蛋白诱发草鱼肠炎模型中，草鱼肠道上皮内淋巴细胞中，哺乳动物免疫耐受相关细胞因子的同源基因表达均显著上调[11]。细菌攻毒虹鳟后，il1b、tnfa、ifng、il8和tgfb等细胞因子在前肠中的表达上调，而tgfb基因在后肠的表达却显著下调[12]，说明部分肠道上皮内淋巴细胞具有调节T细胞的功能。进一步研究肠道调节T细胞功能，对研究硬骨鱼口服免疫耐受机制有重要作用。

1.2 DNA疫苗免疫机制

DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答[13]。与此同时，来源于DNA疫苗质粒的DNA基序、mRNA转录本或表达的蛋白质抗原都可激活机体天然免疫机制。有研究发现，空载体质粒DNA可能诱导部分免疫保护，细菌基因组DNA中常见的未甲基化CpG基序可被机体作为病原体相关分子模式加以识别，从而激活免疫系统的巨噬细胞、B细胞等，也可与类Toll受体结合，激活Th1通路[14]。疫苗质粒的双链DNA可被细胞内的模式识别受体识别，通过TANK结合激酶1介导，激活天然免疫系统，刺激机体干扰素的合成[15]。伴随着Mx、IFN-γ等干扰素诱导基因表达的上调，miR-462和miR-731表达也上调，表明microRNA也参与干扰素介导的免疫保护[16]。

2 渔用DNA疫苗研究

水产病害可分为病毒性、细菌性及寄生性病害，水产疫苗对细菌性病害的作用效果较好。自20世纪80年代以来，水产疫苗已在水产养殖中得到大规模应用，大多数商用疫苗是灭活菌苗，少量是基因工程重组苗[17]。2007年，第1个水产DNA疫苗通过审批，水产DNA疫苗研究进入新阶段[18]。DNA疫苗是一个包括强启动子、目标基因及转录终止序列等关键元件的细菌质粒。已有研究主要聚焦在特异启动子筛选、多基因(抗原)表达和DNA疫苗与适合载体及佐剂的配合使用等方面。

2.1 启动子优化

人巨细胞病毒(HCMV)启动子是一种常用的DNA疫苗启动子，在鱼和虾细胞中可高效表达[19-20]。筛选适合的鱼源启动子，提高水产DNA疫苗的细胞表达特异性，对提高DNA疫苗生物安全性有重要意义。比较草鱼肌动蛋白启动子疫苗和HCMV启动子疫苗发现，虽然其免疫保护率相似，但鱼源启动子可诱导更强的特异免疫反应[21]。Ruiz等[22]利用鲤鱼上皮细胞株体外比较了10种不同鱼源启动子的表达效率，发现来源于虹鳟的Mx启动子、斑马鱼内源反转录病毒长末端重复序列(LTR)和草鱼肌动蛋白基因启动子(AE6)的体外表达效率最高。如果在质粒表达框两侧插入来源于三文鱼的反向重复序列，则表达效率更高。通过比较截短启动子序列后的质粒表达效率，发现以Mx或LTR的核心序列替代HCMV启动子相应序列后，在培养细胞中具有相似的抗原表达水平；当Mx增强子与LTR或AE6核心序列组合，在培养细胞中抗原表达最高[23]。

2.2 抗原基因

2.2.1 病毒病抗原基因

传染性造血组织坏死症病毒(IHNV)和出血性败血症病毒(VHSV)是对三文鱼养殖危害极大的2种病毒，除DNA疫苗外，其他类型疫苗研制均较困难。目前已完成了病毒基因组测序、病毒蛋白鉴定及不同病毒分离株基因变异分析工作。三文鱼注射免疫IHNV病毒G蛋白质粒后，可以诱导鱼体产生病毒中和抗体，显著提高攻毒后的存活率，而且不同血清型病毒间有抗原重叠，可作为免疫保护抗原，DNA疫苗免疫后的相对存活率大于80%[24]。

胰腺坏死病是由披膜病毒科的鲑胰腺病毒(SPDV)引起的三文鱼病毒病。SPDV病毒由一条正义单链RNA构成，可编码4个非结构蛋白和1个结构多肽链，结构多肽链通过进一步加工，形成5个成熟蛋白，其中糖蛋白E1和E2形成异源二聚体，分布于病毒表面。灭活苗、E2、E1亚单位疫苗均对SPDV病毒表现出免疫保护性，但DNA疫苗对该病毒无免疫保护性[25]。感染性胰腺坏死病病毒(IPNV)也是引起鱼胰腺坏死的病原之一，由线性双链RNA组成，大RNA片段编码衣壳蛋白VP2、小衣壳蛋白VP3和剪接肽链的蛋白酶NS。含完整A片段的DNA疫苗对IPNV病毒表现出良好的免疫保护，而仅含VP2基因的DNA疫苗不具备免疫保护性[26]，也有研究认为，只有全病毒灭活苗有一定免疫保护作用，DNA疫苗和亚单位苗均没有保护性[27]。鲑鱼贫血病毒(ISAV)是鲑传染性贫血病的主要病原，是一种被膜病毒，核衣壳血凝素是主要抗原，以病毒血凝素酯酶的表达质粒免疫后，表现出中等攻毒保护性，而病毒核蛋白表达质粒则无保护性[27]。

β诺达病毒是一类由2条正链单链RNA组成的RNA病毒，可引起硬骨鱼病毒性神经坏死病。虽然重组衣壳蛋白亚单位苗对其具有良好免疫保护性，而DNA疫苗免疫后并不表现免疫保护，而且亚单位苗与DNA苗联合免疫也未能进一步提高亚单位苗的保护性[28]，显示该DNA疫苗并无免疫保护作用。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)是鲤春病毒血症的主要病原，可感染淡水养殖的多种鲤科鱼类品种。SVCV病毒由一条反义单链RNA构成，主要编码5个结构蛋白，其中G蛋白和M蛋白是囊膜的组成蛋白，三聚体的G蛋白位于囊膜外表面，而M蛋白则位于囊膜内表面。研究发现，由CMV启动子驱动的全长G蛋白质粒对其免疫保护效率(48%)较好[29]，且多价苗可同时预防SVCV和锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus，KHV)[30]。

鲤疱疹病毒(CyHV)有多种亚型，其中CyHV-3是锦鲤疱疹病毒病的病原，可造成锦鲤、鲤80%以上的死亡率。CyHV-3具有一条大小约295 kb的双链DNA，包含156个开放阅读框(ORF)，其中ORF65编码主要囊膜蛋白。构建ORF65疫苗质粒并免疫建鲤鱼苗，可显著提高攻毒建鲤成活率[31]。2型病毒(CyHV-2)可导致异育银鲫大量死亡，ORF72、ORF66、ORF81和ORF82融合表达的DNA疫苗，口服或注射免疫可提高异育银鲫的成活率[32]。

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)是鳜鱼病毒病的主要病原。ISKNV主要衣壳蛋白(MCP)是病毒粒子的主要抗原蛋白。以MCP基因构建的DNA疫苗浸泡处理鳜鱼苗，鳜鱼血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和超氧化物歧化酶含量均显著提高，攻毒后死亡率显著下降[33]。

2.2.2 细菌病抗原基因

鳗弧菌是一种严重的细菌性病原微生物，可感染多种硬骨鱼。鳗弧菌中鉴定出5种免疫原性蛋白(VAA，Groel，OmpU，PteF和SpK)，其中4种外源表达的重组蛋白可诱导机体发生白细胞分化及抗体生成。含VAA基因的DNA疫苗质粒可以在培养细胞及牙鲆体内表达VAA抗原蛋白，DNA疫苗免疫后，可对牙鲆提供中等免疫保护[34]；将鳗弧菌抗原VAA与白介素2基因联合构建双顺反子DNA疫苗，共表达VAA抗原和白介素2细胞因子，可以提高攻毒后相对存活率[35]。另外，热激蛋白(HSPs)也可作为免疫抗原，以鳗弧菌热激蛋白基因(Hsp33)构建的DNA质粒可在体内或培养细胞中表达热激蛋白，激活系统免疫和局部免疫，攻毒后免疫保护为42.86%[36]。

豚链球菌是一种水产养殖中危害严重的革兰氏阳性条件致病菌，可感染多种主要养殖品种，如大菱鲆等。在养殖温度过高、密度过大等不利养殖条件下，常造成重大损失，生产中主要以灭活菌苗预防。利用体内诱导抗原技术筛选获得抗原基因sia10，构建表达sia10基因的DNA疫苗，免疫攻毒结果显示具有很好的免疫保护性[37]。已有的研究证实，由9个基因组成的链球菌溶血素S相关基因簇可编码链球菌重要毒力因子，基于该基因簇sagE、sagF、sagG、sagI和H基因的DNA疫苗均可有效诱导免疫反应，免疫个体表现良好的链球菌侵染免疫保护，而且sagH基因DNA疫苗还表现出对不同血清型链球菌的交叉保护[38]。

爱德华氏菌是一种革兰氏阴性致病菌，可感染多种淡水或海水养殖鱼类，发生爱德华菌病，主要症状包括鱼类皮肤损伤、脓肿坏死和腹部肿胀等，严重时会引发鱼类败血症，给水产养殖带来巨大危害。外膜蛋白C(OmpC)是一种孔蛋白，位于细胞外膜，是主要表面抗原。以OmpC的DNA疫苗处理牙鲆6周后，在受体鱼组织中可以检测到OmpC基因的转录本和融合蛋白，攻毒后的相对存活率约为55%[39]。分子伴侣不仅是胞内蛋白折叠、组装与转运的帮助蛋白，同时还是免疫优势抗原，可激发宿主的体液免疫反应和细胞免疫反应。通过构建爱德华氏菌伴侣蛋白基因的表达质粒，免疫牙鲆3～5周后，伴侣分子GroEL基因表达质粒可以诱导牙鲆的免疫反应，产生良好的免疫保护[40]。

水产气单胞菌病是由嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和温和气单胞菌引起的水产病害。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，其外膜主要由脂多糖、磷脂和一些外膜蛋白(OMPs)组成，且OMPs蛋白在不同血清型间较保守，其中Aha1蛋白位于细胞表面，是重要的毒力因子，有很强的免疫原性，可诱导机体产生抗体，根据Aha1蛋白的2个保守域构建DNA质粒并转化培养细胞后，可检测到抗原蛋白表达[41]。Han等[42]分别克隆外膜蛋白OMPG和OMP48编码基因，并构建真核-酵母穿梭质粒，转化酿酒酵母，口服免疫鲫鱼后，免疫组化显示，抗原基因在鲫鱼肠道黏膜上表达，DNA疫苗的免疫保护率为46.7%。

2.2.3 寄生虫病抗原基因

多子小瓜虫属纤毛类原生寄生虫，是世界范围内淡水鱼类的主要寄生虫病原，主要寄生于鱼类表皮和鳃部的上皮细胞，可引起小瓜虫病或“白点病”，是影响淡水水产生产的主要因素之一。已有研究显示，鱼体可以产生保护性免疫反应以抵抗小瓜虫寄生[43]，寄生虫富含的一类表面膜蛋白(I-ags)是有效的免疫抗原，分别构建编码I-ags(Iag52 A、Iag52B)和半胱氨酸蛋白酶(ICP2)质粒，不同质粒组合处理可以诱导三文鱼免疫相关基因表达上调并产生寄生虫特异性抗体，但并不能显著提高免疫保护性[44]。研究发现，单独免疫寄生虫病DNA疫苗尚不能有效激活机体免疫反应，还需要筛选更有效的免疫抗原[45]。

2.3 免疫佐剂

在动物免疫接种时，通常需要疫苗佐剂辅助，以增强机体对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型。水产DNA疫苗的最终研究目标是获得可以诱导鱼体产生长期高水平免疫保护，然而，除少数几种DNA疫苗外，大部分在研水产DNA疫苗的保护性尚不理想，而且由于鱼类没有淋巴结和骨髓等淋巴器官，对疫苗的反应相对较弱。因此，在DNA疫苗研究的同时，筛选适合的免疫佐剂，以达到增强免疫的作用。

2.3.1 细胞因子

细胞因子是一类能在细胞间传递信息的蛋白质或小分子多肽，具有免疫调节及效应功能有干扰素、白介素、趋化因子等。与哺乳动物干扰素类似，草鱼的IFN除了可以调节趋化因子和炎症细胞因子的产生、激活巨噬细胞发挥吞噬作用、刺激一氧化氮和具有抗菌活性的氧中间体的产生和释放外，还可以促使Th0细胞分化成Th1细胞，诱导B细胞中免疫球蛋白类型的转换和主要组织相容性抗原复合物(MHC)Ⅰ类、MHC Ⅱ类分子和APC协同刺激分子的表达，在胞内细菌感染和宿主抵抗病毒的过程中有重要的作用[46]。Chang等[47]研究发现，IFN质粒作为佐剂可显著提高DNA疫苗的保护效率。Cao等[48]研究发现，在适合剂量下，细胞因子均对DNA疫苗免疫后的抗原基因表达有显著作用。一般来说，疫苗注射部位抗原提呈细胞数量决定了疫苗诱导免疫反应的程度。因此，将趋化因子作为佐剂，则可提高DNA疫苗的免疫反应[49]。

2.3.2 调节因子

MyD88是一种激活信号通路、产生炎症因子的转接分子，在哺乳动物的白介素1受体及Toll样因子介导的核因子NF-κB激活通路中有重要作用，可作为DNA疫苗的佐剂，提高疫苗的免疫反应[50-51]。DDX41是DDX蛋白家族成员，参与信号传导、基因启动子调节、RNA剪接及蛋白质翻译过程。以共表达VHSV病毒抗原G蛋白和XXD41的双启动子质粒免疫牙鲆，可显著提高攻毒后30 d的存活率，说明DDX41是DNA疫苗的有效佐剂[52]。

2.3.3 病毒复制子

病毒复制子是在病毒基因组结构中至少剔除1个编码结构蛋白的病毒基因，具备可编码非结构蛋白且不能组装成新病毒的特性。在哺乳动物细胞质中，α病毒复制子的复制酶复合体可以激活天然免疫和特异性免疫反应，具有免疫佐剂的功能。构建可表达三文鱼α病毒复制酶的佐剂质粒并与灭活ISAV病毒联用时，可显著提高免疫保护率，提示该病毒复制子可作为免疫佐剂使用[53]。

2.3.4 小RNA

microRNAs(miRNAs)是进化上保守且广泛存在于真核生物中的一类非编码单链小RNA，主要通过抑制靶基因的表达或翻译来发挥转录后调控作用。Lim等[54]通过在VHSV病毒G蛋白表达质粒中插入一个miR-155表达盒后，发现新质粒可显著提高血清杀病毒活性，说明质粒转录的miR-155可以提高先天免疫反应，可以作为佐剂分子。

2.4 口服DNA疫苗载体

DNA疫苗经多种接种途径进入动物体内，被动物宿主细胞吸收后，转录和翻译表达抗原蛋白，通过刺激机体产生非特异性和特异性免疫应答反应从而起到免疫保护作用。口服DNA疫苗具有操作简单、费用节省、鱼体应激反应低、可在幼体期进行免疫等优点，但口服后质粒DNA在肠道生理环境极容易发生降解，为了避免或减少肠道酸性环境及各种肠道核酸酶对质粒分子的降解作用，设计了多种载体，以提高口服途径吸收质粒分子的完整性。

2.4.1 活菌载体

在对疫苗传递系统的研究中，期望获得一种能在机体体内较长时间存在且对机体本身安全，又能产生持续免疫力的传递载体。乳酸杆菌是动物胃肠道的常在菌群，可作为口服DNA疫苗的运载工具，诱导局部或全身黏膜免疫反应。在水产免疫研究中，乳酸杆菌常作为益生菌加以利用，尚未见作为疫苗载体的报道[55]。Huang等[56]研究发现，尼罗罗非鱼减毒鼠伤寒沙门氏菌无乳链球菌口服液DNA疫苗可诱导鱼体产生抗体，提高攻毒后的免疫保护率，说明减毒菌苗可以作为DNA疫苗的载体。酵母是一种常见的真核表达宿主，在简单、低成本培养基中可快速生长，同时，菌壁主要成分β葡聚糖具有免疫活性，是一种良好的生物饲料添加剂，已有研究发现，重组酿酒酵母可作为一种新型的口服DNA疫苗载体[57]。

2.4.2 微粒载体

随着纳米材料和技术的发展，纳米微球载体研究取得了飞速发展，其具有副作用少、缓释、长效、避免胃肠道消化水解等优点，可以作为DNA疫苗传送载体，提高质粒DNA分子抵御肠道降解环境能力，已有研究使用乳化技术，利用壳聚糖、PLGA等包被抗原，制备DNA口服疫苗[58]。

2.5 DNA疫苗安全性

水产DNA疫苗潜在的安全性主要涉及2个方面。对受体鱼来说，外源DNA可能与基因组整合，干扰正常的生理过程，或者诱导产生自体免疫等不良反应；对消费者来说，水产品中可能残存的带有哺乳动物启动子和抗生素抗性基因的质粒，具有潜在的整合进入基因组或肠道菌群的风险。截至目前，水产免疫还没有这2方面的研究报道，但从数千例DNA疫苗的人体安全性观察的初步结果看，DNA疫苗对宿主没有明显的副作用[59]，且没有影响人类健康问题的事件发生[60]。DNA疫苗免疫后，质粒可能通过被接种鱼的分泌物、排泄物或遗体的腐败物向外界环境释放。质粒DNA进入环境后会被逐步降解，可通过遗传改造，使质粒DNA失去移动能力，大大降低其被自然环境中微生物吸收、繁殖和扩散的可能性[61]。

3 小结

水产疫苗的研究开发工作正在全世界范围内蓬勃发展，随着生物技术的不断进步，水产疫苗的使用也呈快速发展势头，并将有效解决因化学药物滥用而导致的水产品质量安全和环境污染问题。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有众多优点，是21世纪新型疫苗发展的趋势，而水产口服DNA疫苗由于具有给药方便等优势，因而是研究热点。目前DNA疫苗仍面临2个主要问题：第一，公众对其安全性的担忧。尽管疫苗质粒或DNA疫苗受体鱼并不属于转基因范畴，第一例水产DNA疫苗也通过审批，然而对长期使用DNA疫苗可能引起的各种反应仍缺乏长期深入的研究，未来需在以鱼源启动子替代哺乳动物启动子、改造质粒载体等方面加强研究，以减轻人们对DNA疫苗及相关产品的消费安全和环境安全的担心。第二，目前在研的大部分水产DNA疫苗，特别是水产口服DNA疫苗，其引发的体液和细胞免疫达不到理想的状态。通过比较哺乳动物和水产模式鱼类的免疫机制差异，鉴定鱼体早期天然免疫反应的产生机制，及其与长效获得性免疫间的相互作用等，进一步解析鱼免疫机制研究。另外，在水产口服DNA疫苗研究中，需考虑如何确定给药剂量、时间及保护专一性等问题；在评价免疫保护时，除了比较免疫组与非免疫组，还需要与传统疫苗(灭活苗、减毒苗)比较；改进攻毒方法，以尽可能反映自然养殖环境中情况，病原微生物的侵染途径；开展口服DNA疫苗载体及佐剂研究等，使水产口服DNA疫苗能在不久的将来，更好地为水产产业服务。