石油降解菌的筛选、鉴定及降解石油研究

刘永江 解蕾 刘书慧（青岛大港海关，山东 青岛

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石油产品广泛应用于生产生活各方面，包括工农业，交通运输业等各行业，石油被称为黑色的金子，随着经济发展，石油产量不断提高，世界产油国家地区有150多个，年产石油总量超30亿吨。随着石油工业发展，大量含石油物质废水排入土壤，石油带来的环境污染问题日益突出，对石油污染土壤修复治理，对保护生态环境具有重要意义。污染土壤治理中，微生物修复由于具有费用低等优点受到人们重视，为污染土壤修复带来技术革命。

1 已有研究综述

通常所称石油是从地下开采未提炼的原油，经提炼加工可制成多种燃料，包括天然气，煤油等。石油颜色多为黑色，少数为暗绿色。常温下呈流体状态，粘度范围宽，沸点范围为常温到500℃以上，石油物理性质差异原因是化学组成不同。石油化学组分复杂，随产地不同有差异。碳氢元素为烃类化合物存在，石油中含有几十种微量元素。石油主要由烷烃等烃类化合物组成，烃类化合物相对分子质量范围很大，石油烃以固液气三态存在于石油中。烷烃是组成石油的主要成分，石油非烃组分有6种[1]。

石油污染土壤对生态环境产生严重危害，荷兰在80年代花费15 亿美元进行土壤修复工作，美国在2005 年用于石油烃污染场地修复资金棕色土地基金达2200万美元。石油污染土壤处理方法可分为理化处理与生物处理。80年代前，污染土壤治理仅限于理化处理，化学处理主要有土壤洗涤法等，物理处理包括隔离法等，理化处理法能快速净化土壤中石油污染，但其固有缺陷限制了应用范围，物理方法去除污染物时破坏土壤结构，化学方法试剂造成土壤二次污染。生物修复是利用生物生命代谢减少土壤有毒物质浓度，使污染土壤环境恢复到原始状态，生物修复类型可分为微生物修复，动植物修复。生物修复具有费用低，对环境影响小等有点，美国EPA 修订法案将生物修复定为原有污染土壤修复首选措施，我国环保局提出重点研究微生物处理技术[2]。

国外开展微生物质量石油污染研究较早，发达国家发展较为成熟，欧美土壤生物修复技术已得到应用。我国自70年代开始有学者关注相关研究，但实际研究较少，90年代发展快速，综合运用微生物学，生态学等方法，开展生物毒理学，生物工程技术研究。研究主要集中于降解石油微生物研究，石油理化特性对微生物降解作用的影响，环境因素对微生物降解作用的影响。目前对石油污染微生物修复技术研究取得了很多的进展，但仍存在一些问题，如修复技术工艺有待完善，复合菌群协同作用降解机制不清楚。本文研究胜利油田石油土壤修复技术，通过实验筛选复合菌群，利用气相色谱法对复合菌群降解后残余石油组分分析。获得针对油田地区石油污染土壤修复的微生物菌群资源，对菌群菌株增殖培养进程初步研究，利用气相色谱对组成菌株降解后石油组分分析，解释复合菌群对石油烃降解率提高的原因。

2 石油降解筛选鉴定实验

3 种不同的土壤样品均采自山东胜利油田，原油与市售0#柴油按1∶4的比例混合均匀。

富集培养基：K2HPO4·3H2O 1.0g， MgSO4·7H2O 0.5g， Ca⁃Cl2 0.02 g，FeCl3 痕量，蒸馏水1 000 ml，121℃灭菌20 min，加入5 g石油。种子液培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基。

筛 选 培 养 基：NaNO3 1.5 g ，K2HPO4 1g KCl 0.5 g， Ca⁃Cl2 0.002 g，蒸馏水1 000 mL，加入2.5 g石油。加入1.2%的琼脂制成相应的固体培养基。

称取5g污染土壤加入富集培养基的三角瓶中，恒温摇床条件下培养。转接至新鲜培养基，连续富集培养25 d，经梯度稀释后涂布在固体PDA培养基上，待平板长出菌落后，采用划线分离法反复进行分离纯化，纯化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨培养基斜面。

将菌株接种到降解用液体培养基的三角瓶中180 r·min-1的条件下培养5 d，稀释后涂布在固体培养基上，观察各菌株生长情况，筛选出生长较快的菌株。挑取单菌落接种到液体牛肉膏蛋白胨培养基三角瓶中，恒温摇床中培养24 h，用牛肉膏蛋白胨培养基调节其质量浓度。吸取5 ml 准备好的种子液接种到筛选培养基三角瓶中，恒温摇床中培养4d后测定石油含量，计算平均降解率。

采用试剂盒提取并纯化石油降解菌总DNA，对16S rDNA保守序列进行扩增。PCR 反应体系如下：反向引物与正向引物各1 µl， ddH2O 补足至50 µl。PCR 反应条件：94℃预变性5 min，50℃退火1 min，此步骤共进行35个循环，。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检验并进行测序[3]。

通过BLAST 程序的序列进行对比分析查找相似的核苷酸序列，利用软件构建系统进化树。构建系统进化树的方法使用Neighbor-Joining法，进化树可靠性检验选用自展检验DNA 序列变异中的转换赋于相同的加权值。

4 结语

从胜利油田采集的石油污染土样，分离到50株细菌，将纯化的细菌单菌落接种到培养基中培养。经梯度稀释后涂布在固体培养基上，结果初步筛选出生长较好的33株细菌。

对菌株进行石油降解能力的测定。石油降解率超过30%的细菌共16株。不同菌株对石油的降解能力不同，菌株PU-34的降解率达到58.38%，其余4 株菌分别为PU-15、PU-4。选取降解率高的菌株做鉴定。

对筛选出的石油降解率较高的菌株进行形态观察。从PU-34、PU-2的16S rDNA 中扩增得到基因片段，将PCR产物纯化后测序得到目的基因序列。与核酸序列进行比较，找出同源性较高的序列进行对比分析构建系统发育树。

PU-34 和黄单胞菌属的11 个种的模式株序列同源性在96%～99%范围内，PU-34 与Pseudoxanthomonas mexicana 聚为一簇。PU-34为好氧的革兰氏阴性杆菌，不能水解淀粉和尿素，不产生吲哚，结合生理生化特性确定PU-34属于P.japonensis。

PU-15 与戈登氏菌属很多种的模式株16S rDNA 序列同源性，挑选同源性较高的模式种构建系统进化树，PU-15 与食烷烃戈登氏菌的Gordonia alkalivorans DSM 44369T 位于同一分支PU-2与友好戈登氏菌的模式株位于同一分支。

国内外很多研究结果报道从样品中分离出假单胞菌属、一些菌株具有较好的石油烃降解能力。假黄单胞菌属是根据对Pseudoxanthomonas 的描述建立的，对分离自环境的嗜温细菌进行研究建立了新种。并对假黄单胞菌属的描述进行了修订。国际权威杂志报道了4 株污染土壤中分离的假黄单胞菌属细菌，包括台湾高雄分离筛选到的生物活性剂的细菌，分离的P.spadix IMMIB AFH-5T，从加油站沉积物中分离的菌株P.spadix BD-a59，以从污染土壤中分离的P.sacheonensis BD-c54T。石油降解菌经鉴定为P.japonensis菌种，假黄单胞菌属的某些菌株生物修复方面具有研究价值。