一种检测生物硫醇的荧光探针

周柯岩,杨瑜涛, 李华肖, 李玮

(1.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 教育部药物化学与分子诊断重点实验室，河北 保定 071002)

硫醇是一种含有巯基官能团的一类非芳香族化合物.其中小分子生物硫醇主要包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，它们在生物体内参与多种生理活动，在蛋白质的合成、氧化还原、细胞的抗氧化等重要的生理过程中发挥着重要作用[1].作为一种可以天然产生的氨基酸——半胱氨酸(Cys)，其具有刺激造血机能，促进皮肤损伤修复的作用[1-2]，细胞内 Cys 的缺失，会造成肝脏损伤、毛发减少褪色等等.人体中一个非常重要的中间代谢产物——高半胱氨酸(Hcy)，其在人体中的含量大于 10 μmol/L 则会表现为临床异常[3-8]，含量过高会导致血管内皮细胞损伤、心血管病、骨软弱症、精神疾病等等.细胞内含量最高的一种硫醇——谷胱甘肽(GSH)，可以参加多种机体的生化反应，其在免疫方面发挥着重要作用[9]，其含量与衰老、过敏、肿瘤、脂肪肝、艾滋病等有着重要的联系. 近年来，用来检测生物硫醇类的小分子荧光探针受到了广泛关注.小分子生物硫醇的荧光探针的检测主要基于亲核加成反应[10-13]、断键分解反应[14-16]、金属络合物置换配位反应[17]等反应机理.本文成功设计并合成了一种基于色烯衍生物的荧光探针 1，该探针能够实现对生物硫醇的快速、高灵敏度和高选择性的“关”-“开”型荧光信号响应.

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

1.1.1 主要实验仪器

ZF-20D 暗箱式紫外分析仪，600Hz 核磁共振仪(Bruker)，Agilent Technologies Cary 60紫外-可见分光光度计，Agilent Technologies Cary Eclipse 荧光分光光度计，Agilent Technologies 质谱仪.

1.1.2 主要实验试剂

1.2 溶液配制及光谱测定

用 DMF 制备探针的储备液，配制溶度为 2×10-3mol/L，各种氨基酸和阴离子均用去离子水配制，浓度为 2×10-3mol/L.紫外和荧光光谱在 PBS-DMF(10 mmol/L，体积比1∶1，pH=7.4)中检测获得，荧光光谱激发波长为 395 nm，光栅狭缝 5 nm /5 nm，电压为 600 V 条件下获得.

1.3 荧光探针的制备与表征

荧光探针的合成路线见图1.

化合物2∶5-氯-2-羟基-1，3-(亚苯基)二甲醇；化合物3∶5-氯-2-羟基-3-(羟甲基)苯甲醛；化合物4∶色烯衍生物.

1.3.1 化合物4(色烯衍生物)的合成

将化合物3(0.372 g，2 mmol)、环戊烯酮(0.164 g，4 mmol)以及咪唑(0.136 g，2 mmol)加入到圆底烧瓶中，用溶剂V(THF)∶V(H2O)=1∶1进行溶解，在 30 ℃下缓慢搅拌 72 h，点板监测，直至反应完毕，得到深棕色溶液.用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，通过真空浓缩，除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(V(PE)∶V(EA)=2∶1)分离得到黄色固体(0.25 g，质量分数50%).

1.3.2 化合物3(5-氯-2-羟基-3-(羟甲基)苯甲醛)的合成

将化合物2(20 g，106 mmol)和二氧化锰(20 g，230 mmol)加入到圆底烧瓶中，将其溶解于 300 mL 氯仿中，在0 ℃下搅拌反应 1 h，点板监测，直至反应完毕. 将反应液通过真空过滤，收集滤液，将其真空干燥，除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(V(PE) ∶V(EA)=15∶1)分离得到白色晶体(11.04 g，质量分数56%).

1.3.3 化合物2((5-氯-2-羟基-1、3-(亚苯基)二甲醇)苯甲醛的合成

将氢氧化钠(6 g，150 mmol)溶解在 20 mL 水中，向其溶液中加入对氯苯酚(19 g，150 mmol)，缓慢搅拌至溶解，且溶液变为金黄色，再向其中加入多聚甲醛(9 g，300 mmol)，加热到 50 ℃，反应 1 h，至有黄色固体产生，停止反应，将其溶解于热水100 mL中，用HCl调至 pH 1～2，真空过滤，真空干燥，得到浅黄色固体(26.89 g，质量分数98%).

1.3.4 探针1的合成

将化合物4(0.32 g，1.5 mmol)和氧化剂 PCC(0.32 g，1.5 mmol)，溶解于二氯甲烷中，室温搅拌，点板监测，直至反应完毕，停止反应，真空浓缩除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱(V(PE)∶V(EA)=7∶1)得到黄色固体(0.11g，46%质量分数).探针的核磁表征如图2.1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ：10.40(s，1H)，7.76(d，J=2.5 Hz，1H)，7.4(d，J=2.5 Hz，1H)，7.14(d，J=2.4 Hz，1H)，5.42～5.39(m，1H)，2.83～2.78(m，1H)，2.69～2.64(m，1H)，2.44～2.37(m，1H)，2.28～2.21(m，1H)，13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：200.3，187.2，155.9，135.0，133.4，129.6，127.8，125.3，125.1，124.6，76.4，36.9，27.9.

1H NMR(CDCl3，600 MHz)；13C NMR(CDCl3，150 MHz).

2 结果与讨论

2.1 探针1对生物硫醇的光谱研究

首先，笔者进行了探针 1 识别生物硫醇的滴定光谱研究，在含有探针 1 (50 μmol/L) 的PBS-DMF(体积比1∶1，pH 7.4，10 mmol/L)缓冲体系中展开，以 GSH 为例进行研究.如图3a 所示，将 GSH 加入到探针 1 的溶液中，随着 GSH 的加入，最大吸收峰的波长不断增加，直至加入50 μmol/L当量的 GSH，最大吸收峰的波长不再增加.此时，最大吸收峰的波长发生了 47 nm的红移.如图 3b 所示，是与之相对应的荧光滴定光谱，探针 1 对生物硫醇有较强的响应，随着 GSH(50 μmol/L)的加入，在 514 nm 处的荧光强度不断增加.与空白体系相比，饱和体系的荧光强度是空白体系的 56 倍.

2.2 探针1对识别生物硫醇的选择性研究

图4 探针1对生物硫醇的(a)紫外-可见吸收光谱选择性实验和(b)荧光光谱选择性实验

2.3 探针1对生物硫醇检出限的研究

笔者根据探针 1 对 GSH 的荧光光谱数据分析计算得出检出限.首先通过对探针1溶液(50 μmol/L)扫描 10 次，测定其在 514 nm 处的荧光强度，计算出标准偏差σ，然后通过探针1在不同浓度的 GSH 在 514 nm 处荧光强度与 GSH 浓度的做出工作曲线，其线性方程为Y=14.583 87c(GSH)+30.372 53，R2为 0.990 02，根据检出限计算公式 3σ/k、经过计算得出探针1对GSH的检出限低达0.12 μmol/L，表明探针1对生物硫醇的检测有较高的灵敏度(图 5).

2.4 探针1对生物硫醇的动力学研究

笔者进行了探针1与生物硫醇的动力学研究，以GSH为例进行研究.如图 6 所示，探针1(50 μmol/L)溶液中加入GSH(50 μmol/L)后，荧光强度明显增加，直到 2 min 后不再增加. 结果表明，探针1能够快速检测生物硫醇.

图5 514 nm处荧光强度与不同浓度GSH的工作曲线

图6 探针1与GSH的反应时间

2.5 探针1的pH研究

研究了 pH 对探针 1 识别生物硫醇的影响，选择不同(3～12)pH 的PBS-DMF(体积比1∶1，10 mmol/L)作为缓冲条件，以GSH为例进一步展开.如图7所示，探针1本身在pH处于3～10内，探针基本维持不变；而加入GSH后，pH在6～12内荧光强度明显增加. 结果表明，探针 1 对生物硫醇的响应可以在较宽的范围内进行.

图7 pH对探针1识别 GSH 的影响

3 总结

成功合成一种色烯衍生物类的小分子荧光探针 1 用于生物硫醇的选择性检测.通过核磁对其结构进行了表征，并且紫外可见光谱和荧光光谱实验表明，该探针能够实现对生物硫醇的快速检测(2 min)，检测限为 0.12 μmol/L. 因此，探针 1 可对细胞中的硫醇浓度进行检测.