中国长江与荷兰野生中华绒螯蟹的头胸甲形态特征比较

姜晓东，成永旭，潘建林，李晓东，吴旭干

(1.上海海洋大学农业农村部淡水种质资源重点实验室，上海 201306；2.江苏省淡水水产研究所，南京210017；3.盘锦光合蟹业有限公司，辽宁盘锦 124200；4.上海海洋大学水产动物遗传育种上海市协同创新中心，上海 201306；5.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范心，上海 201306)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)简称河蟹，是我国主要的经济养殖蟹类[1]。虽然河蟹是中国的土著甲壳蟹类并广泛分布于沿海诸省的各大水域，但在欧洲和北美洲等海外地区也有大量分布[2-3]。主要是由于20世纪初河蟹被偶然带入德国，它们在海外大量繁殖并形成了数量庞大的种群，随着分布范围不断扩大，现已遍及欧洲大陆和北美洲大陆各水系[4-5]。有关欧美大陆与中国各水系河蟹之间亲缘关系，已有研究结果表明欧美地区河蟹与中国长江水系河蟹的亲缘关系最为接近[6-8]。

由于常使用小规格亲本近亲繁殖以及不同水系间的盲目引种和杂交，我国长江流域河蟹种质退化严重，而欧美地区河蟹一直在相对封闭的环境下生长繁育，未受到人为影响和相近种群的基因污染，很好地保持了长江水系河蟹的优良基因和生长特性[9-10]。中国长江水系与欧洲地区河蟹亲缘关系接近但生长性状差异明显，如何通过形态特征鉴别两群体河蟹显得尤为重要。王武等[11]在通过聚类分析和判别分析探究中华绒螯蟹和日本绒螯蟹形态特征差异的研究中，曾以荷兰境内莱茵河野生河蟹作为对照，而长江水系与欧洲地区河蟹形态特征之间的直接比较目前尚未见报道。近年来，随着计算机图像处理技术和统计学的发展，地标点几何形态测量法在水生动物形态的研究中得到应用，其中以甲壳类和软体动物为代表的无脊椎动和以鱼类为代表的脊椎动物的研究最为广泛[12-13]。然而，目前地标点法应用于河蟹种群鉴别的研究较少，仅见于区分长江水系不同产地的池塘养殖河蟹，而运用地标点法比较不同地理种群河蟹形态特征的研究鲜有报道[14]。为此，该研究以河蟹头胸甲作为研究对象，探讨地标点法对中国长江与荷兰野生河蟹的鉴别效果，以期更全面地了解欧洲地区河蟹的形态特征，为欧洲地区河蟹的合理利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2018年分别于江苏镇江和荷兰艾瑟尔湖的天然水域中采集野生河蟹，每一地理种群随机采集性成熟且四肢健全的雌雄样本各20只。为避免时间不同造成的操作误差，所有野生河蟹运输回实验室后均暂保存于-40 ℃冰箱，待所有样本采集齐全后统一处理。各水系河蟹的采集时间、采集地点以及平均体质量等信息如表1所示。

表1 长江与荷兰河蟹样品采集信息表Tab.1 Sampling information of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

1.2 测量方法

1.2.1 地标点的建立与提取

该研究以河蟹头胸甲作为数据采集对象，采用单反相机(Nikon D300)在相同目镜物镜倍数下拍摄取得头胸甲形态的二维影像。拍摄时镜头与样品间的距离为30 cm左右，头胸甲放置于成像区域的正中位置，使得镜头同样与头胸甲垂直。利用tpsDig2软件在拍摄好的头胸甲图片上建立地标点(图1)，获取相应地标点的x、y坐标值并建立数据文件。由于河蟹形态特征表现为雌雄二态性，该研究中雌雄个体分开采点分析[15]。

图1 河蟹头胸甲的地标点位置图Fig.1 Landmark locations on the carapace of E.sinensis

1.2.2 数据分析

用tpsRelw软件经普氏叠加得出地标点的分布情况，对每个样本的地标点进行平移置中、旋转和缩放等处理去除非形状差异并得到标准化数据，据此进行局部扭曲和相对扭曲主成分分析。保存软件生成的相对扭曲得分(relative warps scores,RW)矩阵和分析报告，用于后续采用Bayes方法进行逐步判别分析，分析软件为 SPSS 24.0。利用tpsRegr软件进行薄板样条分析，绘出各水系河蟹的网格变形图，比较形态差异。

2 结果

2.1 两群体的头胸甲形态特征的主成分差异

相对扭曲主成分分析共提取了9个主成分，其中前2个主成分的累积贡献率均超过50.00%(表2)，说明第一和第二主成分可以概括两群体之间主要的形态特征差异。从第一和第二主成分绘制的散点图(图2)可以看出，无论雌体还是雄体，长江与荷兰个体均完全分离且各自形成较为集中的区域。

表2 相对扭曲得分主成分的特征值与贡献率Tab.2 Eigenvalues and contributions of the first three principal components of relative warps scores

2.2 两群体头胸甲边缘额刺和侧刺可视化差异

利用tpsRelw软件根据地标点数据文件计算的平均形和重叠后的效果如图3所示，通过tpsRegr软件进行扭曲、回归分析和置换检验后的网格图如图4所示。通过比较平均形与两群体网格图可以发现，两群体之间存在差异的形态特征主要为头胸甲边缘额刺和侧刺的位置。

2.3 区分两群体的判别效果

利用SPSS进行逐步判别分析时，分别从雌雄个体的相对扭曲得分中筛选出对判别贡献率较大的5个变量建立判别方程，用于两群体河蟹的初步判别，判别方程系数见表3。逐步判别分析结果显示，长江与荷兰群体的各20只河蟹样本中，雌雄蟹的判别准确率均为100%(表4)。因此，利用基于地标点法的几何形态学测量可以有效判别两群体野生绒螯蟹，且判别效果较好。

3 讨论

3.1 地标点法的鉴别效果

本研究中基于地标点的几何形态测量法在长江和荷兰野生河蟹的区分中取得了较好的识别效果。判别分析中两群体河蟹的判别准确率均为100%，而之前在比较中华绒螯蟹和日本绒螯蟹形态特征中，荷兰境内莱茵河野生河蟹基于传统形态测量法的判别准确率为92.80%[11]，稍低于本研究中基于地标点几何形态测量法的判别准确率。此外，主成分散点图中两水系河蟹完全分离且各自形成较为集中的区域，并通过差异可视化分析发现了两水系在额刺和侧刺上的形状差异，这些结果均说明地标点法可以将这两群体河蟹有效区分。

图2 长江和荷兰野生河蟹形态特征的第一和第二主成分散点图Fig.2 Scatter plots of PC1 and PC2 of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

图3 长江和荷兰野生河蟹头胸甲的平均形(A)和叠加图(B)Fig.3 Mean shape(A) and vectorization(B) of landmarks on carapace of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

图4 长江和荷兰野生河蟹头胸甲的网格变形图与变异可视化(变异扩大3倍)Fig.4 Grid deformation of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands(variations were enlarged 3 times)a.雄体;b.雌体;1.YR群体;2.HL群体.

地标点法的鉴别优势主要在于可去除非形状变异的干扰，将研究对象的形状视为一个变量来进行比较，从而找出传统形态测量中较难发现的形态差异特征[16]。除此之外，地标点还能够以图形化的方式直观地再现形态差异，清晰展现导致形状差异的主要性状以及性状变化的趋势[17]。地标点法在其他水生动物上亦有较好的体现：Ponton[18]分别使用传统测量法、傅里叶法和地标点法比较鉴别三种半棱属(Encrasicholina)鱼类和印度小公鱼(Stolephorusindicus)的耳石形态特征差异，其结果表明，地标点几何形态测量法对耳石的鉴别效果好于另外两种方法，并可以展现出耳石在鱼类生长过程中的变化趋势；苏杭[19]通过不同形态学测量方法对柔鱼(Ommastrephesbartramii)和茎柔鱼(Dosidicusgigas)的群体鉴别和差异性进行分析，研究发现，相对于传统测量学法和傅立叶分析法，地标点法对不同头足类具有更好的判别效果。

表3 长江和荷兰野生河蟹的判别方程系数Tab.3 Discriminant function coefficients of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

表4 长江和荷兰野生河蟹的判别分析结果Tab.4 Classification results of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

虽然本研究中地标点法对两群体河蟹的识别效果好于之前的传统测量方法，但该方法在取点过程中的不确定性和随机性，很可能会影响识别效果。例如，冯波等[20]在运用传统形态测量方法和地标点方法对广东阳江和湛江两个短吻鲾(Leiognathusbrevirostris)的形态特征进行分析比较的研究中，由于所选取地标点的位置或数量不当，传统形态测量方法反而表现出较好的区分效果，由此可见，地标点法的应用效果很大程度上取决于取点的准确性。因此在选取地标点的过程中，既要尽量选取合适的地标点又要剔除无效地标点，在降低地标点间相关性的同时尽可能涵盖研究对象的形态特征信息。

3.2 形态特征差异的原因

本研究结果不仅验证了地标点法的鉴别效果，同时也发现两群体头胸甲之间明显的形态特征差异。之前的研究表明不同地理条件下水生动物的形态差异与其栖息环境相适应，底质、水流、温度和食物等环境因素均能产生如体形和行为等方面的差异[21]。本研究中两群体河蟹所生存的长江与荷兰艾瑟尔湖的环境条件各具特点，两群体形态特征在生长过程中均产生了适应性变化，加之近一个世纪的地理隔离，从而形成明显的形态特征差异。

绒螯蟹属的种类区分和种群识别中，头胸甲上额刺、侧刺、疣突和凹槽等形态结构均为重要的分类依据[22-23]。本研究形态差异可视化分析中额刺和侧刺的形态特征同样差异较大，主要表现为长江群体的额刺和侧刺长度稍长于荷兰群体，而疣突和凹槽位点差异较小，这与之前研究中环境变化主要影响甲壳动物头胸甲额刺和侧刺长度以及疣突和凹槽明显程度的结论相一致[24]。在之前形态可塑性的研究中，美洲蓝蟹(Callinectessapidus)在含有敌害生物的环境中蜕壳数次后侧刺长度显著增加，体现出甲壳动物侧刺在野外环境中抵御敌害的功能，此外，不同水系野生河蟹移至池塘并人工养殖一代后形态特征趋于一致，因此该实验中两群体间的形态差异还可能与其所属水域的生物资源特性有关[25-26]。与侧刺相比，四肢作为河蟹接触自然环境的直接部位，应当可以更充分地反映环境差异所导致的形态特征差异，但如何突破硬组织的限制而采集河蟹附肢等结构稳定性较差部位的形态信息，仍需进一步尝试。

综上所述，地标点法能够较为有效地揭示长江和荷兰河蟹的形态特征差异，并可用于两水域河蟹的群体识别，具有很好的应用前景。在下一步的研究中，需要增大样本量、补充不同地理种群、筛选更合适的特征地标点，以期更全面地了解欧美地区河蟹的形态特征。