基于iKnife智能手术刀质谱技术金枪鱼内脏脂质组学研究

王海星 张燕平 李诗言 陈 康 饶 伟 沈 清

(1浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江工商大学海洋食品研究院,浙江杭州 310012；2浙江省麻醉重点实验室,温州医科大学附属第二医院育英儿童医院,浙江温州 325000；3浙江省水产质量检测中心,浙江杭州 310023；4沃特世科技上海有限公司,上海 200120)

脂质组学是对生物体、组织或细胞中的脂质进行全面系统的鉴定分析,了解脂质的结构和功能,进而揭示脂质代谢与生物生理、病理关系的一门学科[1-5]。脂质组学已成为国际研究热点[6],现已被广泛应用于食品科学等多学科领域[7-10]。随着对脂质组学研究的逐渐深入[11],脂质组学分析方法也越来越多元化[12-14]。但传统脂质组学分析方法中,样品前处理过程耗时耗力,无法满足高通量快速分析的需求。

iKnife智能手术刀质谱是一种无需任何样品前处理,实时检测样品中目标化合物的一种新型敞开式电离质谱技术[15]。iKnife智能设备基于电外科手术刀开发,由高频电刀和质谱分析仪两部分组成。与传统手术电刀不同的是,该技术可在术中对组织样品进行实时质谱分析鉴定,iKnife用电烧灼组织过程中产生带电气溶胶,经文丘里系统吸入质谱端口并进行代谢物成分分析,从大数据中提取有用信息并将分析结果投射在触摸屏监控器上,该技术在国外主要应用于医学研究,可在手术过程中根据脂质代谢物组成对肿瘤组织进行实时诊断识别[16-17]。

金枪鱼,又名鲔鱼、吞拿鱼,素来以高营养、纯天然、无污染而享誉国际,其肌肉富含蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸和必需矿物质元素等[18-20],其中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)2种多不饱和脂肪酸含量非常丰富[21]。近几年,全世界金枪鱼年产量稳定在400万t左右,产值达300多亿美元,已成为我国海产品的主要补充和加工出口鱼种[22]。金枪鱼主要加工为生鱼片[23]和各类罐藏食品[24],然而其可利用部分仅为50%～70%,内脏等加工过程中产生的副产物由于缺乏先进的高值化加工技术而得不到较好的利用,大部分被当做饲料或直接丢弃[25]。

本研究拟优化iKnife智能手术刀质谱参数,建立实时脂质组学技术方法对金枪鱼内脏中磷脂成分进行研究,探索金枪鱼内脏的营养价值,深入研究金枪鱼副产物的脂质代谢物组成,以期为金枪鱼副产物的快速质谱分析检测及综合利用提供重要的科学依据与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、丙二醇,色谱纯,购自美国Merck公司；亮氨酸脑啡肽,美国Sigma公司；试验用超纯水；金枪鱼内脏组织样品,浙江兴业集团有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Xevo G2-XS四极杆飞行时间质谱仪,配有特制的iKnife智能手术刀(SJ350B),北京东方神键医疗器械有限公司；REIMS质谱进样接口,英国Waters公司,试验装置如图1所示；Pump11 elite针泵注射进样器,美国Harvard公司；Milliplus2150超纯水处理系统,美国Millipore公司；Sorvall高速冷冻离心机,美国Thermo Fisher公司；Masslynx 4.1数据采集软件和LiveID统计分析软件,美国Waters公司。

图1 iKnife智能手术刀质谱装置图Fig.1 The setup of iKnife intelligent monopolar electrode mass spectrometry

1.3 试验方法

1.3.1 样品准备 将金枪鱼内脏等副产物于冰温解冻,用滤纸擦拭表面水分,置于实验台面待iKnife智能手术刀质谱检测。

1.3.2 质谱条件 使用iKnife智能手术刀切割金枪鱼内脏组织表面,形成含有大量磷脂离子的气溶胶,经Venturi泵氮气(2 bar)驱动,采用正交方式经聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene,PTFE)管引入质谱仪,主要装置如图1；以丙二醇/亮氨酸脑啡肽混合物为辅助溶剂,经针泵注射进样器以0.1 mL·min-1的流量引入快速蒸发离子化质谱(rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)接口,用于进样管路清洗,提高信号强度、锁定质量校正；质谱接口内设Kanthal A1灯丝(1.1 Ω,3 V,800℃)用作辅助碰撞电离,离子碰撞后进入质谱仪StepWave装置；质谱仪扫描时间:1s；扫描范围:m/z 100～1 200；质谱模式:灵敏度模式；进样补偿电压(offset potential):12 V；所有数据均以负电离模式收集。

2 结果与分析

2.1 iKnife智能手术刀质谱条件优化

影响iKnife智能手术刀质谱信号响应的因素包括Q-TOF质谱仪常规参数和离子源部分参数,其中,常规参数主要为碰撞解离电压和氮气压强。由于相关研究报道已较多,因此本试验中不再探讨和赘述。决定金枪鱼内脏组织表面磷脂离子化效率的因素主要为电刀切割输出功率和切割速率,以特征磷脂离子峰m/z 745.5、790.5、885.6和909.6的信噪比为指标优化参数。

由图2-A可知,iKnife输出功率对磷脂离子信号影响较为明显。当功率较低时能量偏低,金枪鱼内脏组织表面化合物离子化不充分；当功率过高时,容易产生较多的基质化合物,对目标离子产生干扰。试验首先以5 W的iKnife输出功率切割金枪鱼内脏,目标磷脂离子均能较好地产生信号响应,且其信噪比随着输出功率的提高呈现上升趋势；当输出功率为15 W时,各个磷脂离子信噪比均达到最高值,分别为34.9(m/z 745.5)、60.5(m/z 790.5)、21.3(m/z 885.6)和 58.0(m/z 909.6)；当进一步提高输出功率时,磷脂离子信噪比反而下降,且趋势逐渐加强。因此,试验设置iKnife输出功率为15 W。

当切割速度较慢时,iKnife在金枪鱼内脏组织表面驻留时间较长,容易导致特定区域组织焦糊化,进而产生过多基质离子；当切割速度过快时,组织表面化合物离子化不完全,信号响应较低。由图2-B可知,在0.5～2.5 mm·s-1范围内优化切割速度并选取最佳试验条件,当以1 mm·s-1的速度切割金枪鱼组织时,各个特征磷脂离子峰信噪比均达到最高,过快或过慢均会造成信噪比下降。因此,试验过程中iKnife切割金枪鱼内脏组织时速度保持在1 mm·s-1。

2.2 金枪鱼副产物检测

通过对金枪鱼副产物直接进行电刀质谱分析,扫描范围m/z 100～1 200,同时以亮氨酸脑啡肽(m/z 554.261 5)为内标锁定质量并校准质量轴,得脂质组学轮廓图(图3)。金枪鱼内脏组织表面化合物可离子化形成2簇较为显著的离子峰簇。m/z 200～450区域为小分子化合物离子,主要离子峰为m/z 239.1和m/z 222.1等,其化学结构尚不明确；m/z 391.2和 m/z 419.3疑似超长链脂肪酸FA 26:2和FA 28:2。由于本试验主要研究对象为磷脂,因此未对上述化合物结构做进一步研究鉴定。其余中低丰度离子为FA 20:5、FA 22:6等鱼类常见脂肪酸离子[26]。磷脂分子主要分布在m/z 650～950区域,其离子信号丰度较强,通过对m/z 600～1 000区域放大分析(图4-A),m/z 790.5响应最高,随后分别为m/z 745.5、m/z 909.6以及m/z 763.5等。

图2 不同电刀切割功率输出和切割速度条件对特征磷脂信噪比的影响Fig.2 Effect of different electric power output and cutting speed on the signal-to-noise ratio of representative phospholipid ions

图3 iKnife智能手术刀质谱实时获取金枪鱼副产物脂质组学图谱Fig.3 The mass spectrum of tuna byproduct using iknife intelligent monopolar electrode mass spectrometry

2.3 磷脂分子鉴定与丰度分析

对质谱图4-A降噪、去同位素等处理,筛选峰面积大于1.00E+05的离子峰,根据其分子质量测定值推算其可能的化学结构,并使用串联质谱/二级质谱(tandem mass spectrometry,SMZ)进行验证。以m/z 885.55为例,其离子质量与[PI 38∶4-H]-(C47H82O13P-,885.549 9)最为接近,通过子离子扫描(product ion scan)将母离子解离得到图4-B,可明显观察到由m/z 885.55断裂的脂肪酸链子离子m/z 283.2(FA 18:0)和m/z 303.1(FA 20:4),碳原子数和双键数与前期推测38:4吻合,故可确认 m/z 885.55为[PI 38∶4-H]-。通过这种方法可对大多数磷脂离子结构进行确认,部分低丰度离子因为离子信号响应不足未做MS2确认。由表1可知,金枪鱼内脏中共鉴定出磷脂离子峰41种,质量范围m/z 699.5～911.6,根据信号强度采用归一化法计算相对丰度,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为1.02～4.71。信号最强离子峰m/z 790.5经鉴定为[PE 40:6-H]-,相对丰度达到10.03%；其次为m/z 745.5([PA 40:7-H]-),相对丰度为9.02%。

表1 金枪鱼内脏中磷脂成分与相对含量Table 1 The composition and relative contents of phospholipids in tuna byproduct

图4 金枪鱼副产物中主要磷脂成分质谱图Fig.4 The mass spectrum of phospholipids from tuna byproduct

2.4 方法验证

选取m/z 745.5、790.5、885.6和909.6为特征离子对iKnife智能手术刀质谱金枪鱼内脏检测方法进行验证,结果见表2。首先对方法选择性进行分析,考察磷脂质量偏差及杂质对质量轴的干扰,以m/z 790.5为例其结构鉴定为[PE 40:6-H]-(C45H77NO8P-),负离子模式下离子计算值为m/z 790.538 7,实际测定值为m/z 790.541 8,经计算其误差值为3.9×10-6。目标离子的误差范围在1.4～4.5×10-6范围内,表明iKnife智能手术刀质谱质量测定精确,选择性好。方法精密度采用日内和日间精密度衡量,使用iKnife智能手术刀连续平行切割金枪鱼内脏组织5次,根据相对含量计算质谱图中目标离子RSD,得到日内精密度；以相同试验条件连续平行测试7 d,计算RSD获得日间精密度。结果表明,该方法日内精密度为3.8%～5.1%,日间精密度为4.3%～6.3%。

表2 iKnife智能手术刀质谱金枪鱼内脏中磷脂检测方法验证Table 2 The validation of iKnife intelligent monopolar electrode mass spectrometry method for lipidomics profiling of tuna byproduct

3 讨论

现有的常规液相-质谱联用分析方法操作过程复杂繁琐,极大地限制了其在食品科学领域的应用。iKnife智能手术刀质谱是一种无需任何样品前处理的实时质谱分析方法。该方法在原位将样品直接表面离子化,获得质谱脂质组学轮廓图,使用LiveID等软件识别轮廓图并对特征离子峰降维、建模后,可实现对未知样品的实时鉴定与准确度评分。由于前端未联用高效液相色谱等分离技术[27],所以目前iKnife智能手术刀质谱相关研究主要以定性为主。因此本研究主要关注金枪鱼副产物的脂质组学轮廓和相对丰度,而未对各个脂质分子的绝对含量做具体讨论。

与之前的iKnife智能手术刀质谱相关研究相同[16-17],本研究从金枪鱼内脏中检出代谢物组成也是以脂质为主,其中磷脂分子种类最多的是磷脂酰肌醇(phosphatidyli nositol,PI),共检出13种PI分子。脂质以外其他极性较大、稳定性较差的代谢物的检测,需要对组织样品的汽化蒸发能量进行深入的优化,降低切割能量,并进一步提高检测方法的灵敏度。但是,切割能量的降低,会大幅降低脂质化合物的汽化蒸发电离效率,不利于脂质组学研究。本研究中,生物体中含量最多的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)分子检出较少,可能是由于iKnife智能手术刀能量较高,电切过程中通过电能传输导致PC丢失N(CH3)3,如m/z 699.50([PC-N(CH3)3]-)等；部分PC直接脱落胆碱基团而生成[PA-H]-,印证了结果中较多[PA-H]-的检出,如 m/z 719.5([PA 38∶6-H]-)、m/z 745.5([PA 40∶7-H]-)等。汽化蒸发电离能量或切割能量,可直接决定质谱图谱中检测到的代谢物,因此,是影响本研究结果的重要影响因素之一。对PC的深入研究,可将质谱仪转换成更适合PC离子化的正离子模式,并对电切能量进行相应优化后进行。大量磷脂代谢物的同位素离子峰容易在质谱图中重叠,影响其鉴别,除本研究采用的二级碎裂质谱法外,在以后的研究中,还可以利用最新的离子淌度谱对不同迁移速率的离子进行快速分离后,再进行质谱分析检测,尽量避免质谱图中大量离子峰的重叠交叉。

由于磷脂在生物组织中主要以细胞膜形式存在[28],无法人为构建空白样品和梯度浓度标准样品体系,因此本研究在验证iKnife智能手术刀质谱新方法时直接以信噪比为指标检测方法的灵敏度,验证结果表明该目标离子在前期优化的试验条件下信号响应强,信噪比为21.3～60.5,iKnife智能手术刀离子化能力强,灵敏度高。日内和日间精密度结果表明,该方法的精密度高,结果可重复。上述结果充分证明iKnife智能手术刀质谱可满足金枪鱼及其他水产副产物的脂质组学研究的需求。

4 结论

本研究建立了一种利用iKnife智能手术刀质谱实时脂质组学研究金枪鱼内脏的方法。通过优化电刀输出功率、切割速率等参数,提高了特征磷脂的信噪比和信号稳定性。由于国内目前尚未有iKnife相关技术研究报道,该成果可为生物质谱技术发展提供参考,并为金枪鱼内脏的营养价值研究提供参考,为金枪鱼副产物中脂质检测与综合利用提供依据与支持。