橡胶树茎干褐斑病病原鉴定及室内防治药剂筛选

蒋桂芝，李 丽，刘一贤，周 明*

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100；2.勐满农场管委会农林水服务中心，云南勐腊666309）

云南植胶区由于特殊的气候环境，橡胶树病害种类较多，随着种植时间延续，一些新病害在不断发生，并逐渐显现出经济上的重要性。上世纪90 年代，云南植胶区持续发生橡胶树小蠹虫（Bark beetle）为害［1］；2003-2004 年，西双版纳持续橡胶树盔蚧（Parasaissetia nigraNitner）大发生［2］；2005 年，在云南河口发生橡胶树棒孢霉落叶病[Corynespora cassiicola（Berk. & Curt.）Wei]［3］；2012-2013 年，在云南景洪发生镰刀菌（Fusariumsp.）侵染引起橡胶树的茎基腐病和茎干溃疡病［4］，等等。这些病虫害的发生都给生产带来不同程度的损失。

2014 年4 月，笔者在对云南省主要橡胶种植区进行病害普查的过程中，在景洪市勐养农场发现一种橡胶树茎干褐斑病，造成橡胶树茎干树皮溃疡，症状表现为：在感病部位表面有少量点状棕褐色分泌物，分泌物干后呈浅茶色印迹或黑色点状，树皮表层粗皮没有变色坏死现象，感病严重的橡胶树产量大幅下降，同时可引起小蠹虫为害导致橡胶树死亡。此次发现的褐斑病与已知的由疫霉菌（Phytophthorasp.）［6］、镰刀菌（Fusariumsp.）［6-7］引起的橡胶树茎干溃疡有明显的差异。为找到相应的防治措施，笔者对勐养的感病病株进行了采样和病原分离，依据形态、致病性、分子生物学对病原菌进行鉴定，并作病原菌适宜生长温度及防治药剂筛选测试，为进一步开展防治技术研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试病样及植株：于2014 年4 月在云南省景洪市勐养农场银河生产队感病橡胶树采集罹病样品35 株，其 中GT1 品种13 株，PR107 品种12 株，RRIM600 品种10 株。用刀刮除病斑及病健交界处树皮的表层粗皮，然后用灭菌手术刀切取大小为0.3～0.5 cm×0.3～0.5 cm 病健交界处树皮组织，放到无菌的塑料小瓶中作为病原菌的分离材料，带回实验室。分别选用种植3 年的云研77-2幼树和种植14 年的正常橡胶树（林下株）茎干为接种材料。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉17 g、水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 褐斑溃疡病病原菌的分离及鉴定

病原菌的分离及形态鉴定：将采集的样本放在直径5 cm 的培养皿中用75%酒精消毒30 s，凉干后在培养皿中加入0.1%的升汞液，使样品完全浸在升汞液中消毒处理1 min，随后将消毒处理过的样本放到灭菌水中清洗1 min，重复清洗3 次，然后用灭菌滤纸吸取样本外多余的水分，将处理好的样本放置在PDA 培养基平板上25℃培养，培养5～7 d 后PDA 平板上有菌落形成。将所得菌落孢子依据方仲达（1990）［8］方法进行单孢分离，依据Hirooka［9］和庄文颖［10］的文献进行形态学鉴定。在PDA 平板上继代培养得到纯培养菌株，用于致病性试验。

ITS 序列比较和系统发育树分析：依据DNA快速抽提试剂盒说明书提取菌丝体中的DNA，利用ITS1/ITS4 引物对其进行扩增和测序［11］。rDNA ITS 区序列扩增及分析采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1（5′-TTCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′），扩增该病原菌5.8 S rDNA 及其两边的ITS1 和ITS2 基因片段。扩增反应体系50 μL：真菌DNA 模 板0.5～1.0 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μ mol/L ITS4 1 μ L、2× Master Mix25 μ L、ddH2O 10 μL，加水补至50 μL。 PCR 扩增程序：预变性94℃5 min；变性94℃30 s，50℃45 s，72℃45 s，35 个循环；最后72℃延伸7 min。PCR 扩增产物使用琼脂糖凝胶回收，纯化后的PCR 产物克隆至pGEM-T-Easy 载体，并委托生工生物工程（上海）有限公司完成测序。将该病原菌的ITS 序列与GenBank 中核酸数据库中有关序列进行同源性比较，在NCBI 数据库中筛选已公布的丛赤壳菌株ITS 序 列，采 用 软 件Mega 7.0 中 的NJ（Neighbor-Joining）法对选中的ITS 序列进行系统发育树分析，确定其分类地位。

1.2.2 分离物致病性的测定试验及再分离

因橡胶开割树与幼树的树皮厚度、结构差异较大，在感病症状和时间上会表现不一致，同时考虑到材料的来源，先进行橡胶幼树致病性测定试验，感病后再作橡胶割胶树致病测定试验。

测试病原菌在PDA 平板上培养7 d 后，用灭菌打孔器将菌落打成直径5 mm 菌丝块备用。

（1）橡胶幼树致病性测定试验：在橡胶幼树茎干距地面1.0 m 左右的高处用直径5 mm 的打孔器打深度为2 mm 的孔，用灭菌滤纸吸去小孔中渗出的胶乳，然后在小孔中接种备好的测试菌丝块，对照接种直径5 mm 的PDA 琼脂块，随后用保鲜塑料薄膜包裹保湿。第3 天除去包裹塑料薄膜，开始观察接种点树皮组织的变化，以后每隔2 d 观察1 次，当树皮组织出现坏死变褐感病症状后再进行病原菌分离，得到与接种一致的菌落时确认为病原菌。

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（2）橡胶割胶树致病性测定试验：在割胶树茎干按同样方法（打孔深度5 mm）接种。第7 天除去包裹薄膜开始观察，以后每隔7 d 观察1 次，当树皮组织出现与田间感病症状一致，再进行病原菌分离，得到与接种一致的菌落时确认为病原菌。

1.2.3 病原菌适宜温度的测定

将病原菌扩繁后用灭菌的打孔器打成直径5 mm 的菌丝块，分别接种在PDA 平板上，置于5、10、15、20、25、30、35、40℃温度和80%RH 的培养箱中培养，5 d 后取出，用数显卡尺测量菌落生长直径，依据各处理菌落生长情况确定病原菌的适宜温度。

1.2.4 防治药剂的筛选试验

根据农药对病原菌的不同作用机理，选取11种农药开展试验，依据各农药的推荐使用浓度选中间值计算配制各试验农药的浓度，然后将其配制成含毒培养基。50%异菌脲可湿性粉剂、50%多菌灵可湿性粉剂、50%腐霉利可湿性粉剂、72%霜脲·锰锌可湿性粉剂、40%多·福·溴菌腈可湿性粉剂、40%嘧菌酯悬浮剂、30%苯甲·丙环唑乳油、240 g/L 噻呋酰胺悬浮剂、20%吡唑醚菌酯悬浮剂、240 g/L 戊唑醇悬浮剂、20%噻菌铜悬浮剂等农药制成含毒培养基的有效成分含量分别为0.5、0.5、0.5、0.72、0.2、0.2、0.3、2.4、0.1、2.4、0.16 mg/L。取250 mL 的三角瓶，分别在每个瓶中装入100 mL 的PDA 培养基，灭菌备用；各种农药按有效成分分别配制成母液，用移液枪将各种农药按比例分别加入装有PDA 培养基的三角瓶中摇匀，制成含毒培养基平板，编号备用。将扩繁好的病原菌平板用灭菌打孔器打成直径5 mm 的菌丝块，分别接种到各农药的含毒培养基上，对照接PDA 平板，在25℃条件、80%RH 的培养箱中培养5 d，观察、记录菌落的生长情况。

1.3 数据分析

采用Excel 2007 和SPSS 21 软件对试验数据进行处理，以Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及形态鉴定

经过培养、分离得到一种菌落，通过多次稀释、单孢分离、萌发培养得到纯化菌株，编号XJ140417。在PDA 培养基上，菌落产浅红色色素（图1-a）；孢子梗不分枝，直立，近圆柱形，顶部渐尖（图1-b）；培养15 d 后，在菌落表面产生疣状物，散生或聚生，表生，为产孢的束丝，新鲜时为橘红色或橙黄色（图1-c）；分生孢子卵形、椭圆形、长椭圆形，无隔，表面平滑，无色，4.1 ～6.1 μm×2.3 ～3.8 μm（图1-d）。根据形态特征，鉴定为丛赤壳科丛赤壳属假毛丛赤壳菌（Nectria pseudotrichia）。

ITS 序列比较和系统发育树分析：病原菌DNA利用ITS1/ITS4 引物进行PCR 扩增，获得555 bp ITS序列（登录号为KX869739），XJ140417 的ITS 序列和已公布的丛赤壳菌序列构建的系统发育树（图2）结果表明，XJ140417 与假毛丛赤壳菌（Nectriapseudotrichia）

图1 PDA培养的的菌落形态、分生孢子梗、束丝及分生孢子

聚为一支，与丛 赤 壳 菌HM48455.4、

KU940138.1 的ITS 序列同源性均为99% ，分子鉴定病原菌为（N. pseudotrichia）。

形态学鉴定和分子鉴定相一致，确定病原菌为N.pseudotrichia。

2.2 分离物的致病性及发病植株再分离

幼树接种试验：接种10 d 后，发现幼树接种点树皮发生褐色病变，症状与田间相似（图3-a），对照不感病（图3-b）。从发病部位重新分离获得病原物，其培养性状和分生孢子形态与接种菌一致，表明菌株为该病的致病菌。

割胶树致病测试：接种5 d 后除去包裹薄膜，接种30 d 形成的病斑较小，持续观察，接种60 d后出现的感病症状与田间完全一致（图3-c）；对照不感病，伤口愈合（图3-d）。从发病部位重新分离获得病原物，其培养性状和分生孢子形态与最初分离物一致，表明菌株为该病的致病菌。

图2222 基于ITS序列病原菌XJ140417和近源物种的系统发育树

2.3 温度对病原菌菌丝生长量的影响

在不同温度下5 d 菌丝生长结果：当温度为20℃时，菌丝生长量达到最大，为61.3 mm；当温度为25、30、15℃时，菌丝生长量分别为47.7、45.0和20.0 mm；在5℃和35℃时，菌丝生长停止。表明该菌最适生长温度为20℃，适宜生长温度为15～30℃，生长范围为5～35℃（图4）。

2.4 防治药剂的筛选

图3 幼树（a和b）和割胶树（c和d）接种后的症状

图4 温度对病原菌菌丝生长量的影响

试验结果（表1）表明：在P＜0.01 水平上，参试11 种药剂药效差异达极显著，其中50%多菌灵、50%多·福·溴菌腈、30%苯甲·丙环唑、240 g/L戊唑醇等4 种药剂效果最好，菌丝生长分别为0.00、0.00、0.30 和0.15 cm，可以完全控制病原菌菌丝的生长，50%异菌脲、50%腐霉利、72%霜脲·锰锌L、40%嘧菌酯、20%吡唑醚菌酯的效果依次递 减，菌 丝 生 长 分 别 为0.85、2.30、4.98、5.13 和5.55 cm，240 g/L 噻呋酰胺和20%噻菌铜的效果最差，菌丝生长分别为8.10 和8.60 cm，且噻菌铜对病原菌菌丝的生长似乎有促进作用。田间防治推荐选用50%多菌灵、50%多·福·溴菌腈、30%苯甲·丙环唑、240 g/L 戊唑醇。

表1 不同药剂对病原菌菌丝生长的影响

3 讨论

云南勐养农场胶园出现的茎干褐斑病主要危害橡胶树主干，早期在感病部位表面有少量点状棕褐色分泌物。笔者从现场采集到茶褐色液体状分泌物样品带回实验室镜检，在分泌物中含有大量的分生孢子，经在PDA 平板上培养，7 d 后形成的菌落形态和分生孢子形态与病斑分离得到的病原菌一致，为假毛丛赤壳菌（N. pseudotrichia）；病原菌在PDA 平板上培养15 d 后产生产孢的束丝，束丝有吐水现象，这种现象或许是橡胶树病斑上有分泌物形成的原因。

由假毛丛赤壳菌引起的橡胶树茎干褐斑病在橡胶上是首次报道。国内外有关假毛丛赤壳菌引起植物病害的报道并不多。国外报道其在巴西和澳大利亚分别引起梨溃疡病［12］和澳洲坚果溃疡病［13］。试验表明，该病原菌菌丝生长最适温度为15～30℃，适宜生长范围为10～35℃，与云南热带和亚热带地区的气候特点［14］相吻合。假毛丛赤壳菌的无性和有性阶段广泛分布在热带和亚热带地区，是双子叶植物常见的病原真菌之一［15］。云南橡胶种植区为热带和亚热带地区，褐斑病的病原菌假毛丛赤壳菌的来源区域与资料记载相符。因而，该病害的发生不是偶然的，是外来物种橡胶树适宜云南热带和亚热带地区环境条件的同时，该病原菌也逐渐适应橡胶树的结果。

对橡胶树褐斑病的观察发现，褐斑病病斑周年都在扩展，在每年的10 月至翌年的3 月扩展速度大于4-9 月，这可能与橡胶种植区每年的10 月至翌年3 月的温度相对较低（一般日温度范围在15～30℃较多），4-9 月的温度相对较高（一般日温度范围在21～37℃较多）有关，也与病原菌假毛丛赤壳菌的适宜生长温度试验结果相吻合。

根据目前研究的结果来看，橡胶树褐斑病将来有可能成为云南橡胶树的主要茎干病害。感病严重的橡胶树后期易受小蠹虫、天牛等钻柱性害虫为害，形成次生虫害，降低抗风性的同时也缩短了橡胶树的经济寿命。因此，对该病害的防治应重在预防和早期治疗。假毛丛赤壳菌对橡胶树的致病机理目前尚不清楚，还需深入研究，才能找到有效的预防和早期治疗措施。