甜橙果肉渣发酵酒工艺条件优化及其品质分析

朱霞建，谈安群，范佳莹，李则灵，周琦，易鑫，李贵节，郭莉，谭祥，黄林华，王华

(西南大学 柑桔研究所，重庆,400712)

橙汁加工过程中会产生大量的果皮渣、果肉渣和种籽等副产物，工业上一般是将这些副产物作填埋处理或直接丢弃，造成资源浪费和环境污染[1-2]。目前，这些加工废渣主要用于提取精油、柠檬苦素、黄酮等功能性成分，存在成本高、提取率低等问题；也可经干燥或发酵后作为动物饲料，但由于味苦、不利于动物消化，利用率较低[3-5]。果肉渣中糖含量约为8%～11%，以小分子糖如葡萄糖、蔗糖、果糖的形式存在，并且含有丰富的膳食纤维，精油含量极低[6]。因此，柑橘果肉渣是优质的发酵原料。

本研究以榨汁后的甜橙果肉渣为原料，结合酶工程技术，通过发酵制备新型柑橘果酒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜橙果肉渣,西南大学柑桔研究所中试车间；果酒酵母RC212、果酒酵母D254、果酒酵母EC1118(A1、A2、A3)，拉曼德公司；果酒酵母SY、果酒酵母RW、高活性干酵母(A4、A5、A6)，安琪酵母公司；没食子酸、绿原酸、咖啡酸等标准品，北京索莱宝科技有限公司；果胶酶(50 000 U/g)，诺维信有限公司；福林酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；NaNO2，Al(NO3)2，Na2CO3等，成都市科龙化工试剂厂,均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；BT224S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Ultimate3000高效液相色谱仪，美国戴安公司;阿贝折光仪，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

操作要点：果肉渣按一定比例加水混匀后打浆，按果浆的总质量加入质量分数0.05%的果胶酶置于45 ℃酶解90 min；成分调整：添加焦亚硫酸钾使SO2质量浓度为50 mg/L后，再用柠檬酸调节pH至4.0。

酵母活化：称取一定量的活性干酵母,加入20倍质量的5%蔗糖溶液，在35 ℃下活化20 min。发酵前期通气搅拌，并观察发酵液中无气泡产生即主发酵结束。继续发酵10～15 d后至残糖量≤12 g/L停止发酵。用100目纱布过滤分离酒渣，酒液转至12～18 ℃下低温陈酿30 d。采用硅藻土进行下胶澄清处理后即为甜橙果肉渣发酵酒。

1.3.2 单因素试验

调整初始糖度为22%、接种量为0.2%、发酵温度28 ℃，考察加水比例(1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2)对发酵酒的影响；选取最佳加水比例，调整初始糖度为22%、接种量为0.2%、发酵温度28 ℃，考察酵母种类(A1、A2、A3、A4、A5、A6)对发酵酒的影响；选用最佳菌种及比例，调整初始糖度22%、发酵温度28 ℃，考察接种量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)对发酵酒的影响；选用最佳菌种及比例，调整酵母接种量为0.2%、发酵温度28 ℃，考察初始糖度(18%、20%、22%、24%、26%)对发酵酒的影响；选用最佳菌种及比例，调整初始糖度22%、接种量0.2%，考察发酵温度(22、24、26、28、30 ℃)对发酵酒的影响。

1.3.3 响应面优化发酵工艺

在单因素试验的基础上，选择以菌种接种量、初始糖度和发酵温度3个因素进行响应面优化试验，以感官评分、黄酮和总酚含量为响应指标，确定果肉渣发酵酒的最佳工艺条件，因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface infermentation process

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 得酒率的计算

得酒率计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4.2 理化指标的测定

酒精度按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》采用酒精计法[7]；残糖量采用直接滴定法测定[16]。黄酮含量参考TIAN等[8]的方法，采用NaNO2-Al(NO3)3方法，稍作改进。以芦丁为标准品，标准曲线的回归方程为：y=719.61x-9.223 5，R2=0.998 7。总酚含量参考DU等[9]的方法，采用Folin-Ciocaltue法，略作修改。以没食子酸为对照品，绘制标准曲线为：y=61.489x+1.999，R2=0.997 2。

1.3.4.3 感官评价

由10位课题组同学经过专业培训后组成感官评定小组，参照葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官评定方法，从外观、香气、口感、风格4个方面，根据表2的评分标准进行评分，最终结果取平均值。

1.3.4.4 酚类物质的测定

样品的制备：取10 mL发酵酒用2 mol/L NaOH调节pH为7左右，加入10 mL乙酸乙酯反复萃取3次取上清液，残液用2 mol/L HCl调节pH为2左右，重复萃取3次后合并上清液，在40 ℃下旋转蒸发至干，用2 mL体积分数80%甲醇复溶，过0.22 μm有机滤膜，待测[10]。

表2 果肉渣发酵酒评分标准Table 2 Criteria for sweet orange fermented wine

色谱条件[11]：色谱柱为Venusil MP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，进样量为20 μL，流速1 mL/min；流动相A为1%冰乙酸溶液，B为甲醇。对于酚酸，洗脱程序为：0～20 min，20%B；20～50 min，50%B；50～60 min，100%B；60～90 min，20%B；检测波长为260、320 nm。对于类黄酮，洗脱程序为：0～30 min，25%～45%B；30～50 min，45%B；50～60 min，100%B；60～90 min，25%B；检测波长283、330 nm。

1.4 数据处理

将3次重复的试验数据以平均值±标准差表示，用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计和结果分析，以Origin 8.0.5绘图软件绘制试验结果图，采用SPSS Statistics 25.0进行差异性显著分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 加水比例对果肉渣发酵酒的影响

不同加水比例对果肉渣发酵酒的影响如表3所示。当加水比例为1∶0.5时，得酒率、黄酮与总酚含量较高，感官评分最高，果酒色泽良好，酒香浓郁协调。此后，加水比例越大，得酒率越高，但总酚和黄酮含量随之降低，发酵所需糖分增大，生产成本增加，果酒中橘香味和酒香味降低，感官评分降低，口味寡淡。由于果肉渣本身水分含量较高，在固态发酵条件下(即加水比例为1∶0)仍能产生酒精，但得酒率较低，果肉渣中的多酚及类黄酮等物质并未充分溶出，导致总酚与黄酮含量较低。因此确定加水比例为1∶0.5。

表3 加水比例对果肉渣发酵酒的影响Table 3 Effects of different material/water ratios on sweet orange fermented wine

注：每列中不同的字母表示显著性差异。下同。(P<0.05)

2.1.2 菌种种类对果肉渣发酵酒的影响

不同的酵母菌种在发酵能力、产香等方面对果酒品质具有重大影响[12]。如表4所示，果肉渣发酵酒的酒精度之间存在显著性差异(P<0.05)。A1、A2、A6菌种发酵酒的总酚与黄酮含量低，口味寡淡，感官评分也较低；A3、A5菌种发酵酒的黄酮含量与感官评分较高，但酒精度与总酚含量低；而A4菌种发酵酒的总酚与黄酮含量较高，酒精度较高，为(11.57±0.04)%，感官评分最高为(84.51±0.9)分，酒体醇厚，柑橘香味与酒香味浓郁协调并且口感较佳，综合分析，选择A4菌种作为果肉渣发酵酒的酵母菌种。

表4 菌种种类对果肉渣发酵酒的影响Table 4 Effect of different species on sweet orange fermented wine

2.1.3 接种量对果肉渣发酵酒的影响

由图1可知，随着酵母接种量增大，酒精度与感官评分先上升后下降，当酵母接种量为0.2%，酒精度最大值为11.4%。这是因为酵母接种量低于0.2%时，酵母菌生长缓慢，产生酒精速度慢，发酵周期延长，口感欠佳；当酵母接种量超过0.2%时，酵母生长代谢旺盛,消耗发酵液中大量的营养物质导致酒精产量较低，同时过多的酵母菌残留不利于果酒澄清并降低发酵酒的风味与口感[13-14]。总酚与黄酮均呈下降趋势，黄酮含量在接种量超过0.2%后显著降低(P<0.05)，其原因是酵母量增加，消耗了多酚及黄酮类物质[15]。综上考虑，选择酵母接种量为0.1%～0.2%之间进行优化试验。

图1 接种量对果肉渣发酵酒的影响Fig.1 Effect of inoculation amount on sweet orangefermented wine

2.1.4 初始糖度对果肉渣发酵酒的影响

由图2可以看出，随着初始糖度的增大，残糖量逐渐增加，酒精度与黄酮含量先升高后降低，总酚含量呈上升趋势。当初始糖度为22%时，酒精度与黄酮含量达到最大值，当初始糖度低于22%时，由于糖分含量不足导致生成的酒精度较低，当初始糖度超过22%时，过多的糖分增加发酵液的渗透压，抑制了酵母菌的代谢活动，酒精度与黄酮含量降低，发酵酒中糖含量增加，导致酒香味不突出，降低了发酵酒的感官品质，与JOSHI等[16]报道的结果相类似。因此选择初始糖度20%～24%进行后续试验。

图2 初始糖度对果肉渣发酵酒的影响Fig.2 Effect of initial sugar content on sweet orangefermented wine

2.1.5 温度对果肉渣发酵酒的影响

一般果酒酵母发酵较适温度范围为25～30 ℃，温度越高，酵母起酵越快，发酵周期越短[17]。由图3可以看出，当温度低于28 ℃时，酿酒酵母生长缓慢，残糖量较高而导致酒精度较低，延长了发酵时间。当温度高于28 ℃时，酵母菌繁殖迅速，衰老快，并且高温下发酵酒中风味物质易挥发，生成的酒精度较低，酒体不浓郁，从而降低了发酵酒的口感与香气。当发酵温度为28 ℃时，果肉渣发酵酒的酒精度、感官评分、黄酮含量较高，残糖量最低，发酵彻底并且酒体丰满醇厚，而总酚含量变化差异不显著(P>0.05)。因此选择26～30 ℃进行优化试验。

图3 温度对果肉渣发酵酒的影响Fig.3 Effect of temperature on sweet orange fermented wine

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

在分析上述各单因素试验结果的基础上，选择接种量、初始糖度、发酵温度3个因素为果肉渣发酵酒工艺的响应变量，旨在保留果酒中的活性成分，同时果酒色香味俱全，因此以感官评分、黄酮和总酚含量为响应指标，对果肉渣发酵酒进行响应面优化和分析。试验方案和结果如表5所示。

表5 响应面试验方案及结果Table 5 Experimental scheme and results for responsesurface analysis

表6 模型方差分析表Table 6 Analysis of variance of each model

注：“*”表示差异显著(P<0.05);“**”表示差异极显著(P<0.01)。

2.2.2 响应面分析

在Y1模型中AB、AC交互作用不显著，因此只对BC交互作用进行分析，由图4A可知，当接种量一定时，发酵温度与初始糖度的曲面较为陡峭，交互作用显著。在Y2模型中BC、AB交互作用不显著，因此只对AC交互作用进行分析。由图4B可知，当初始糖度一定时，随着发酵温度与接种量的变化，黄酮含量的曲面曲率发生显著性改变，二者对黄酮含量影响较大。在Y3模型中，AB、AC交互作用不显著，故只对BC交互作用进行分析，由图4C可知，当接种量一定时，发酵温度和初始糖度逐渐增大时，总酚呈先升高后降低趋势，说明交互作用相当。

图4 各因素对各指标影响的响应面Fig.4 Response surface of temperature and initial sugar content on sensory score(A), temperature and inoculationamount on flavonoids (B), temperature and initial sugar on total phenolic content(C)

2.3 验证试验

感官评分与营养价值是影响消费者购买食品的关键因素，所以本试验中主要目的为酿造的甜橙果肉渣发酵酒色泽口感良好，酒体浓郁协调，同时在发酵过程中尽可能地保留了原料中的类黄酮等营养物质，实现变废为宝的效果。选择感官评分的重要性为4，黄酮与总酚含量的重要性分别为3，选择感官评分为目标范围69.5～85分中的最大响应值，黄酮含量为目标范围110.75～125 mg/L中的最大响应值，总酚含量为目标范围348.15～386.70 mg/L中的最大响应值。通过Design-Expert 8.0.6软件进行数据分析，得到果肉渣发酵酒的工艺条件为接种量0.19%、初始糖度23.79%、温度29.71 ℃，在此条件下模型预测果肉渣发酵酒的感官评分为80.45分、黄酮与总酚含量分别为119.26、386.47 mg/L，考虑实际情况，确定最佳发酵工艺条件为接种量0.19%、初始糖度23.5%、温度30 ℃，在此条件下，平行试验3次取平均值，所得果肉渣发酵酒感官评分为80.12分、黄酮与总酚含量分别为119.10、383.54 mg/L，试验得到的实际值与预测值接近，因此通过响应面优化果肉渣酒发酵条件是可行的。

2.4 品质的分析比较

2.4.1 感官评价

在最优工艺条件下，分别对果汁及果肉渣发酵酒进行感官评价，结果如图5所示，果汁发酵酒澄清透亮，色泽良好，其色泽、澄清度方面高于果肉渣发酵酒。果肉渣发酵酒香气浓郁，柑橘香味与酒香味协调，口感纯正，回味持久，具有柑橘果酒的典型风格，其香气、口感、风格分值均高于果汁发酵酒，与陈红梅等[18]试验结果相似。

图5 果酒感官评价结果Fig.5 Sensory evaluation results of fermented wine

2.4.2 酚类物质含量分析

在最优工艺条件下，分别测定各样品中酚酸及类黄酮物质含量，如表7所示，对应色谱图如图6所示。由表7可知，6种酚酸中，果汁发酵酒中没食子酸、绿原酸、咖啡酸含量均高于果肉渣发酵酒。对羟基苯甲酸在2种果酒中含量相当，无显著差异；相比于果汁发酵酒，果肉渣发酵酒中对香豆酸与阿魏酸的质量浓度均高出2倍以上；在类黄酮物质含量方面，果肉渣发酵酒中除香蜂草苷(3.92±0.06 mg/L)低于果汁发酵酒(4.17±0.04 mg/L)外，其余类黄酮物质含量普遍高于果汁发酵酒。原因是采取带渣发酵时果胶酶能促进果渣细胞壁降解，有助于酚酸及黄酮类物质从木质素中释放出来，从而增加了果酒中酚酸和类黄酮物质的含量[19]。在发酵前后来看，果汁和果肉渣液经过酒精发酵酚类物质含量有所降低，与KELEBEK等[20]研究结果相似。果汁发酵前后除绿原酸含量升高外，其他物质含量均为降低，而果肉渣液整体物质含量下降不明显，含量分别为(171.36±0.28)、(163.91±0.2) mg/L。

表7 果酒中单体酚类物质含量Table 7 Content of monomer phenols in fermented wine

A-酚酸标准品及样品HPLC图；B-类黄酮标准品及样品HPLC图;1-没食子酸；2-绿原酸；3-对羟基苯甲酸；4-咖啡酸；5-对香豆酸；6-阿魏酸；7-芸香柚皮苷；8-芦丁；9-橙皮苷；10-香蜂草苷；11-橘皮素图6 11种酚类物质标准品及样品HPLC图Fig.6 HPLC diagram of 11 phenolic substance standardsand fruit wine

3 结论

果肉渣发酵酒的最佳工艺条件为接种量0.19%、初始糖度23.5%、发酵温度30 ℃，在此条件下，所得果肉渣发酵酒感官评分为80.12分、黄酮与总酚含量分别为119.10、383.54 mg/L。果汁发酵酒与果肉渣发酵酒的品质分析表明，果肉渣发酵酒具有良好的柑橘香味，酒香醇厚，其中的酚酸和类黄酮物质高于果汁发酵酒，含有丰富的营养物质。试验表明果肉渣发酵能获得较高品质的甜橙果酒。

本研究利用甜橙榨汁后的果肉渣，经过酵母酒精发酵，充分消耗原料中的糖类，生产出具有更多功能性成分的果酒，为提高柑橘果酒品质和充分利用柑橘加工副产物提供了新途径，增加了柑橘加工产业的经济效益。