甾体类药物的微生物转化制备技术新进展

吴天飞，潘建洪，方从申，陈 凯

（台州仙琚药业有限公司，浙江 台州 317016）

0 前言

生物催化具有高选择性、环境友好等特点，是现今可代替及拓宽有机合成的一个重要研究领域[1]。全细胞生物催化法因细胞自身所具有的辅酶再生系统，其反应过程中无需额外添加昂贵的辅因子，且酶在细胞内环境中具有较强的催化活性，可省去复杂的胞内酶的分离和纯化步骤[2-3]。甾体类药物具有很强的抗过敏、抗感染能力，已成为除抗生素以外的第二大类药物[4]。甾体类药物化学合成制备存在步骤复杂、收率低等问题，全细胞生物催化法不仅合成过程高效、简便，并且还能合成一些化学法所不能合成的甾体中间体[5]，因而全细胞生物催化技术广泛应用于甾体类药物的制备研究。生物催化反应介质与催化性能有着密切的联系，在生物转化过程中，底物分子需被运送至细胞内，与胞内酶进行反应后再运输出细胞，其中酶的催化能力与其自身酶活性有关，而底物的传质速率则取决于转化体系的性能[6]，因此，选择合适的生物催化反应介质对提高微生物细胞转化合成目标产物的能力至关重要。

1 水相体系

全细胞生物催化过程中，为保证催化体系的稳定性，常使用磷酸盐等缓冲液维持体系pH 及细胞渗透压。然而一般甾体类物质具有很强的疏水性（溶解度范围：10-5～10-4mol/L），而甾体转化酶属于胞内酶，底物只有扩散进入细胞才能与酶接触而进行转化反应，这就导致底物与转化酶不能很好接触，造成转化率偏低，发酵时间延长[7]。因此，开发适用于甾体类化合物微生物转化的新型反应介质体系受到了人们的重视。

2 双水相体系

双水相体系通常指高聚物与高聚物、高聚物与无机盐组成的两相体系，也包括某些低分子有机物与无机盐双水相和表面活性剂双水相体系。其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用，使得无法相互渗透形成均一相。双水相体系中微生物细胞催化的优势，在于它可将细胞限于一相而产物迅速萃取到另一相中，从而可减少产物抑制，或是缩短产物在细胞附近的停留时间来阻止产物的降解[8]。双水相体系粘度较高，也在一定程度上影响生物转化过程中氧传递的速率。杨英等[9]采用分枝杆菌Mycobacterium sp.UV-8 转化植物甾醇为雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）（如图1），考察了高聚物无机盐双水相系统、高聚物高聚物双水相系统对转化的影响，研究表明，由不同高聚物组成的双水相体系都可实现甾醇的转化，且转化率明显高于由高聚物与无机盐构成的双水相体系，当PEG10000 和DEX2000 浓度分别为12%和8%时，转化率达50%左右。王艳婷等[10]利用分枝杆菌Mycobacterium sp.MB 3683 降解植物甾醇转化AD，在组成为200 g 规模的聚乙二醇6000（7 wt%）/葡聚糖70000（8 wt%）双水相体系中，吐温-40 加量为1%（V/V）、转速为240 r/min的优化条件下，豆甾醇投料浓度为10 g/L，转化96 h 后AD 的浓度达1.1 g/L。

图1 植物甾醇微生物转化制备AD

3 双液相体系和微乳体系

双液相体系是指由水相与另一不与水相溶的有机相组成的两相体系。在生物转化中，该反应介质通过底物及产物与细胞的溶解相不同，从而降低了底物和产物抑制。为增强甾体化合物在反应介质中的溶解度，通常加入甲醇、氯仿、异丙醇、环己烷、正庚烷等有机溶剂作为底物溶解相，但有机溶剂也会对细胞产生一定的毒性作用[11]。因此，一般也会选择某些毒性较低的表面活性剂作为增溶剂，如吐温-80、卵磷脂、植物油等。周配等[12]利用分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRLB-3683 转化去氢表雄酮（DHEA，3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮），比较了使用大豆油、花生油、玉米油、山茶籽油、葵花油等植物油溶解底物对生物转化结果的影响，优选出大豆油/水双相体系作为DHEA 生物转化的最适体系，并采用30 L 发酵罐进行了放大实验。反应中添加30%大豆油和25 g/L底物，转化体系pH=8.0，空气流量和搅拌速度分别控制在1.0 vvm 和300 r/min，于30 ℃下转化，转化率为96.76%，DHEA 浓度和产率分别为16.33 g/L 和92.65%。徐阳光等[13]对不同甾醇底物对有机溶剂和环糊精及其衍生物的偏好性进行了研究。结果表明，植物甾醇（混合甾醇）最适于作为侧链降解的转化底物，且底物甾醇对不同的增溶剂无明显偏好性。以有机溶剂作为增溶剂时，乙醇和丙酮在提高产率方面均优于其它有机溶剂；而环糊精作为增溶剂时，甲基-β-环糊精效果最好，当投料浓度为15 g/L 时（环糊精与底物的质量比为2 ∶1），产率仍大于60%。He 等[14]研究了甲苯与Tris-HCl 缓冲液构成的双相体系中添加亲水性离子液体[BMIM][Lac]作为共溶剂对简单节杆菌Arthrobacter simplex UR10611 催化β-羟基甲羟孕酮（HMP）转化为11β，17α-二羟基-6α-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮（PDMDD）的影响，结果表明，体系中加入2%的[BMIM][Lac]时，在80 mg HMP 浓度下，反应16 h，转化率较未添加离子液体的对照试验提高了26.8%。

微乳体系是指由水、油、表面活性剂和助表面活性剂（助表面活性剂通常为酚、短链醇或其他较弱的两性化合物）按适当比例混合后，形成的具有各向同性、热力学稳定的透明或半透明分散体系。杨玉芬等[15]采用简单节杆菌Arthrobacter simplex UR016 在Tween-80/乙醇/食用油/水构成的微乳体系中考察了11β-羟基甲羟孕酮C1，2的生物脱氢能力，在10 g/L 食用油加量，4 g/L 的Tween-80，7%（V/V）乙醇及4 g/L 底物的浓度下，于33 ℃下转化46 h，脱氢转化率达88.6%，较水相转化工艺提高了66.2%，取得了较好的转化结果。

4 含离子液体介质体系

离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由离子（有机阳离子和无机或有机阴离子）所组成的盐，离子液体作为一种新型反应介质，被誉为21 世纪清洁绿色工业中最理想的反应介质之一，它具有非挥发性、强极性和热稳定性好等特点[16]，目前已有将其应用于甾体化合物生物转化的相关研究报道[17]。与其他反应介质比较，离子液体存在粘度大、价格较高的问题。Shen 等[18]利用简单节杆菌Arthrobacter simplex CPCC 140451催化转化醋酸可的松（CA）为醋酸强的松（PA）（如图2）。比较了两种咪唑啉类离子液体对反应的影响情况及相关机制的研究，结果表明离子液体处理后增加了细胞膜的通透性，使得甾体转化效率得到了提高。Huang 等[19]考察了7 种不同的亲水性离子液体和3 种有机溶剂对简单节杆菌Arthrobacter simplex UR016 催化17α-羟基-16β-甲基孕甾-4，9（11）-二烯-3，20-二酮（HMPDD）为17α-羟基-16β-甲基孕甾-1，4，9（11）-三烯-3，20-二酮（HMPTD）反应性能的影响，尽管大多数离子液体表现出较有机溶剂更高的毒性，但在离子液体浓度低于2.5 mmol/L 时，[EMIM][Lac]或[BMIM][Lac]有助于细菌生长，且在[EMIM][Lac]含量为0.3%的最优条件下，转化率达到了93.4%。Wang 等[20]也考察了咪唑啉类离子液体对简单节杆菌催化CA 时的影响，研究表明，侧链上带有3个碳原子的离子液体可增加简单节杆菌对CA 转化率、溶解度和细胞膜透性，普遍抑制了细胞的生长速率和活性，其中[PF6]-阴离子的ILs 抑制活性最强。袁俊杰[21]考察了合成的16 种水溶性离子液体对植物甾醇的溶解能力，结果表明，植物甾醇在12 种四丁基磷／铵脂肪酸盐离子液体中的溶解度可达176～565 g/L，是离子液体[BMIM][BF4]（0.1 g/L）和[BMIM][Lac]（0.4 g/L）的1000 倍，较甲醇中提高了100 倍，比乙醇中也提高了10 倍左右。

图2 简单节杆菌（ASP）转化醋酸可的松（CA）为醋酸强的松（PA）的反应过程

5 含低共熔溶剂体系

低共熔溶剂是指由氢键受体（如季铵盐）和氢键供体（如酰胺、羧酸和多元醇等化合物）在一定比例下组合而成的两组分或三组分低共熔混合物。低共熔溶剂的物理化学性质与离子液体非常相似，因此也有人把它归为一类新型离子液体或离子液体类似物。天然低共熔溶剂因其易制备、无毒、易降解等特点，已被作为一种新型“绿色”介质引入生物催化中[22]。Mao 等[23]研究了3 种低共熔溶剂在简单节杆菌Arthrobacter simplex TCCC 11037 催化CA 反应中的作用，发现反应体系中添加6%的醋酸胆碱/尿素，在5 g/L 的底物浓度下，产率可达93%，与不添加低共熔溶剂的对照试验相比，产率提高了25%。

6 结论与展望

甾体类药物在临床上具有重要的药理活性，市场经济价值很高。在生物催化制备甾类药物过程中，提高其底物溶解度一直是其制备研究的一项难题。利用介质工程构建不同的生物转化介质体系，可很好地解决底物疏水性的问题，其中两相体系能进一步降低底物和产物抑制，对提高底物浓度有着重要的作用。现今，离子液体与天然低共熔溶剂等具有绿色环保优势的反应介质已被应用于甾体类药物的生物转化反应中，为构建新型绿色高效的生物转化反应体系提供了新途径，为甾体药物的制备工艺提供了新的选择。