奶牛乳房炎抗生素替代疗法的研究进展

（中国农业大学动物医学院，北京 100193）

1 抗生素的含义

抗细菌药（antibacterial）也称为“抗细菌剂”，是一类用于抑制细菌生长或杀死细菌的药物[1]。抗生素（antibiotic）是抗细菌药的一种。抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）所产生的具有抑制其他类微生物生长、生存的一类次级代谢产物，以及用化学方法合成或半合成的类似化合物，包括抗细菌抗生素、抗真菌抗生素以及对付其他微小病原之抗生素，但临床上，抗生素常常是指抗细菌抗生素。抗生素的副作用之一是使肠道正常菌群失调[2]。

2 抗生素的耐药性

1928年，青霉素的发现标志抗生素研究进入一个飞速发展的时代。抗生素的发现和应用不但为人类卫生事业做出巨大贡献，也为畜牧业带来了一场革命。然而，我们正面临失去他们的危险。青霉素的发现者弗莱明（Fleming）早在1945年的诺贝尔奖演说中就警告，细菌耐药性的出现可能削弱新发现的青霉素的功效[3]。70年后的现在，弗莱明的警告被证实是有先见之明的：可控制的感染由于耐药性的出现而变得难以掌控。基于现在的研究证明，细菌可以收集许多遗传因素，从而赋予对多种抗生素的高水平的耐药性，进而产生多药耐药（MDR, multidrug resistance）表型[4]。矛盾的是，尽管临床需求不断增长，但曾经是传染病研究和开发的最前沿的制药业却在很大程度上放弃了抗生素，将精力投入到慢性疾病治疗药物的研究上，因为这些药物具有更有利的投资回报前景，例如治疗糖尿病和心血管疾病的药物[3]。这样的局面会导致抗生素与其他药物的革新差距不断扩大，如果得不到解决，我们可能会回到抗生素时代之前的状况，使一些患者只能屈服于曾经可治疗的病原体面前，而得不到有效的治疗，抗生素耐药性的出现使我们处于严重的环境中。

3 动物饲料中抗生素的禁用

许多类型的人为活动，包括农业和水产养殖中的抗生素使用、抗生素的非人类应用以及废物的处置，都产生了重要的抗药性环境储备以及很可能会产生毒力基因和具有庇护能力的生物[5]。自1960年以来，全球牲畜产量大幅增加，这是世界人口增长和对粮食需求增加的直接结果。1950年美国食品与药品管理局（FDA）首次批准抗生素作为饲料添加剂，1994年我国农业部首次发布了《饲料药物添加剂允许使用品种名录》将抗生素列为饲料添加剂。在动物饲料中大量添加抗生素生长促进剂（AGP, antibiotic growth promoters）促进了牲畜生产的增加[6]。但是，自抗生素首次应用在饲料养殖业，对于其副作用的研究就从未停止。关于AGP及其在多药耐药微生物的出现中的作用，引起了全球的关注。AGP的过度使用已导致动物微生物群中产生抗生素抗性，并有可能将抗生素抗性基因从动物转移至人类微生物群[6]。出于这种担忧，许多国家禁止在动物饲料中使用抗生素，瑞典于1986年率先禁止使用AGP[7]。丹麦随后于1998年禁止使用AGP[7]。但是禁止在动物饲料中亚治疗剂量使用抗生素会导致动物产量下降[8]，主要原因是牲畜的感染率较高，同时也增加了消费者食源性感染的风险[9]。为了解决禁止AGP在畜牧生产中使用的相关问题，研究者们已经提出了许多抗生素替代品[8]。

2012年9 月于巴黎举行的世界动物卫生组织（OIE）首届“抗生素替代品”（ATA）研讨会上，重点介绍了有希望的研究结果和新颖的技术，这些技术可能会替代常规抗生素。会上评估了它们的商业化价值，并提供了支持新抗生素开发的可行策略[10]。随后，于2016年12月举行了第二次抗生素替代品专题讨论会，重点讨论了最新的科学突破或技术，这些创新型技术可为预防和治疗动物疾病提供选择和替代策略[11]。中国作为养殖大国，必然也将“禁抗”实施到底，先是在2017年6月22日，农业部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017—2020年）》，该行动提出，推进兽用抗生素物减量化使用，实施“退出行动”，推动促生长抗菌药物逐步退出。如今，自2020年7月1日起，据农业农村部第194号公告，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料，具有替抗作用的功能性饲料添加剂需求有望爆发，可见“替抗”添加剂和药物的研发任务任重道远。

4 奶牛乳房炎的抗生素替代疗法

奶牛乳房炎(bovine mastitis)一般是由传染性或环境性致病菌侵入乳腺造成的感染，其造成的经济损失通常发生在患有亚临床和临床疾病的奶牛身上。有统计显示，由于隐性乳房炎造成的乳制品行业生产损失每年高达10亿美元[12]。奶牛乳房炎是奶牛最常见的和代价最高昂的疾病之一，可导致乳产量的减少、兽医护理成本的升高、抗生素残留的风险以及淘汰或扑杀的损失[13]。乳房炎是大多数奶牛场及其兽医尤其关注的问题之一，但奶农和兽医普遍缺乏专业的培训，且在治疗乳房炎方面对抗生素和激素存在依赖[14]。乳腺感染最常见的传染性细菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），而母牛周围的环境是环境病原体的主要来源，例如乳房链球菌（Streptococcus uberis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和克雷伯菌（Klebsiella spp.）[15]。

奶牛乳房炎的治疗通常使用抗生素，包括在干奶期的治疗和预防。吡美霉、甲氧西林、氯西林、阿莫西林、新霉素、青霉素G、二氢链霉素、头孢氨苄和红霉素均被批准用于治疗和预防牛乳房炎[16]。然而使用抗生素治疗奶牛乳房炎的一个主要缺点是：由于牛奶中的抗生素残留，必须存在一定时间的休药期而造成一定的牛奶损失。另外，由于抗生素的滥用而引起的抗生素耐药性的出现已成为关键问题（WHO, 2018）[17]。这些问题促使人们寻找可以用于对抗奶牛乳房炎病原体的新型抗菌剂或抗生素替代物。本文主要概述奶牛乳房炎的几类抗生素替代物：益生菌、细菌素、噬菌体、溶菌酶、酸化剂、植物提取物和顺势疗法。

4.1 益生菌（Probiotics）

当给予足量时，益生菌是对宿主健康有益的微生物[18]。益生菌可以通过对抗病原体的拮抗活性和免疫调节来控制炎症过程[19]。Bouchard等在2013年体外测试了三种干酪乳杆菌菌株（CIRM-BIA667，BL23，CIRM-BIA1542）预防金黄色葡萄球菌牛菌株（RF122,Newbould305）入侵牛乳腺上皮细胞（bMEC）的能力，其中干酪乳杆菌CIRM-BIA1542 是从奶牛乳头管分离，而其余两株干酪乳杆菌以其益生菌特性而闻名。Bouchard等人证明干酪乳杆菌CIRM-BIA667以菌株依赖性方式影响金黄色葡萄球菌RF122和Newbould305（分别可诱导急性和中度乳房炎）的黏附和/或内化；干酪乳杆菌CIRM-BIA667还可在不影响bMEC形态和生存力的情况下发生保护作用，将两株金黄色葡萄球菌的内化降低60%～80%，一旦内化，金黄色葡萄球菌的命运就不会受到干酪乳杆菌的影响；而热灭活的干酪乳杆菌仍可维持金黄色葡萄球菌的黏附，防止金黄色葡萄球菌内化，对金黄色葡萄球菌产生抑制。该方法为乳房炎主要病原体的新型控制策略提供了新途径[20]。随后，Assis等人同样在2015年证明乳酸乳球菌（V7）可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进入牛乳腺上皮细胞的内在化；当检测乳腺上皮细胞免疫反应时，乳酸乳球菌V7能够诱导其中趋化因子CXCL8轻度增加，并当受到大肠杆菌攻击时，乳酸乳球菌V7可增强免疫应答反应。因此表明，该类益生菌（乳酸乳球菌和干酪乳杆菌）均可用于预防奶牛乳房炎[21]。

4.2 细菌素（Bacteriocins）

细菌素是细菌核糖体合成的抗菌肽，对包括抗生素抗性菌株在内的其他细菌具有活性[22]。细菌素被认为是潜在的抗生素替代品，由于其基因编码可以进行操纵，故可以进行新颖的药物设计[23]。细菌素可以单独使用，也可以与其他已知的抗生素联合使用，以靶向对抗细菌的生物膜[24]。Ceotto-Vigoder等人在2016年测试了乳酸链球菌素（Nisin）和溶葡萄球菌素（lysostaphin）两种细菌素体外对抗金黄色葡萄球菌形成的生物膜的效果。结果表明，用溶葡萄球菌素进行4h的治疗会导致生物膜的分离和固着细胞的死亡，而乳酸链球菌素的处理只会降低细胞的活力。溶葡萄球菌素和乳酸链球菌素同时使用时，会导致固着细胞大量死亡。溶葡萄球菌素与乳酸链球菌素联用可为控制牛葡萄球菌性乳腺炎提供另一种解决方案[25]。

4.3 噬菌体（Bacteriophage）

奶牛乳房炎的另一种替代疗法是噬菌体疗法。噬菌体由含有核酸的头部、尾部和带有刺的底板组成，是可以感染并可以通过细胞裂解杀死细菌细胞的病毒。噬菌体和噬菌体来源的内溶酶在奶牛乳房炎体内和体外模型中多次被评价，其能够在体外有效感染并杀死主要的乳房炎致病菌，如金黄色葡萄球菌，包括耐甲氧西林菌株[26]。

当噬菌体裂解，细菌细胞被感染后，它会在细胞内复制，然后子代噬菌体在细胞裂解后被释放，并继续感染其他细胞。噬菌体的抑制谱通常是菌株特异性的，噬菌体疗法在全球某些地区已经开始使用，主要用以治疗人类细菌感染，由于抗生素耐药性的提高，它再次引起了人们的关注[27]，并作为治疗和预防奶牛乳房炎的新型潜在抗菌药。

4.4 溶菌酶（Bacteriophage endolysins）

溶菌酶可以特异性降解宿主细胞壁的肽聚糖，从而裂解细菌，可作为抗革兰氏阳性菌的潜在抗菌剂。Donovan等人成功分离并纯化金黄色葡萄球菌噬菌体phi11溶菌酶，其具有两个肽聚糖水解酶结构域（内肽酶和酰胺酶）和一个SH3b细胞壁结合结构域。该溶菌酶完全可以在牛乳环境中使用。目前已鉴定出全长为481个氨基酸的金黄色葡萄球菌溶菌酶phi11，其抗菌性在pH6.7和游离钙浓度（3mM）下均具有活性，而此环境与牛奶一致。该纯化的溶菌酶蛋白可以溶解金黄色葡萄球菌和6种凝固酶阴性葡萄球菌，使其成为强有力的候选蛋白抗菌剂[28]。

4.5 酸化剂（Acidifiers）

酸化剂包括有机酸和无机酸，不同种类的酸化剂抗菌功能亦不同。其主要功能是提高生长性能、加快消化进程，增加胰蛋白酶的分泌从而抵抗有害菌，增加有益菌。而抗菌机理主要集中于渗透杀菌、透化细胞膜、降低环境pH值三方面。牛磺酸是一种重要的酸化剂，Zheng等人用牛磺酸抑制临床型奶牛乳房炎患牛乳中分离的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌取得了显著效果。牛磺酸是大多数动物组织中含量最丰富的游离氨基酸，它及其衍生物在先天免疫应答中具有关键作用，可将其用于治疗各种局部感染和慢性炎症疾病；在与乳腺上皮细胞互作过程中，牛磺酸可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌TLR2、TLR4上调，显著抑制金黄色葡萄球菌iNOS上调，并下调促炎因子（如TNF-α），上调抗炎因子（如IL-10）、趋化因子（如Eotaxin），使TLR活化介导的一些重要因素（如MyD88）均被抑制；TAK-242还可抑制ROS和NAGase活性。因此，牛磺酸可以调节大肠杆菌感染时的炎症反应，通过影响TLRs介导的信号通路和提高细胞抗氧化能力来防止细胞损伤，其抗氧化能力也是抵抗金黄色葡萄球菌感染所引起炎症的主要手段[29]。

4.6 植物提取物（Plant extract）

植物及植物的主要提取物也是如今的抗生素替代疗法的研究热点之一。中国知网上目前与利用中草药提取物治疗奶牛乳房炎相关的博士论文共有16篇，主要集中于具有抗菌、消炎、抗肿、镇痛等功能的单体提取物如甘草总黄酮[30]和复方提取物如苦参碱类生物碱传递体凝胶剂[31]。中草药含有大量的生物碱、鞣质、多糖、挥发油、皂甙以及有机酸类等物质，这些物质具有调节机体免疫系统、直接作用病原微生物、修复受损组织器官等功效，而且中草药还具有低毒、低残留、不易产生耐药性等特点，所以在治疗细菌生物被膜疾病方面具有广阔的前景。早在1997年，Hu等人就使用鱼腥草素硫酸氢钠（HSB），由硫酸氢钠与鱼腥草素反应形成的产物，进行乳房内治疗，并且成效显著。不论是临床还是微生物治愈率，对急性和亚急性乳房炎的治疗与青霉素G联合1g链霉素（PS）效果几乎相同；PS在48h内对乳酸链球菌有抑制作用，但是对于HSB，在处理12h内对牛奶中的乳酸链球菌有轻微的抑制作用[32]。

此外，在反刍动物日粮中，叶子是大多数天然草场不可或缺的组成部分，化学研究表明，诸如丹宁酸之类的叶子成分具有沉淀蛋白质、抗微生物作用。Min等人在2008年用八种来自美国俄克拉荷马州的不同木本植物中纯化的缩合单宁处理三种致病菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌），研究其对细菌体外生长的抑制作用。结果表明，单宁提取物时金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长有抑制作用，并呈剂量依赖性和敏感性；8mg/mL的新橡木（Shinnery oak）和星毛栎（Post oak）的提取物高度抑制金黄色葡萄球菌；50mg/mL漆树（Sumac）、铁掃帚草（Sericea lespedeza），李子树（Plum）、山茱萸（Skunk bush）单宁提取物对肺炎克雷伯菌无效，而100mg/mL 漆树的单宁提取物对肺炎克雷伯菌则有比青霉素更好的抑制作用[33]。说明来源和浓度是影响单宁酸抗菌活性的重要因素。植物单宁提取物对选定的病原体具有高度抑制作用，可以作为常规抗菌饲料添加剂的替代品和补品。

4.7 顺势疗法（Homeopathy）

顺势疗法是替代疗法的一种。顺势医学药物对治疗母牛的乳腺炎能产生良好的疗效，这不仅可迅速提高母牛的健康，还可避免牛奶因使用抗菌素治疗而被污染，从而保证牛奶的质量与生产量。Schultz的一项观察性试验表明Dolisovet®可提高产奶量并降低牛奶的体细胞数。Dolisovet®是一种顺势疗法药物，主要成分为颠茄制剂、紫雏菊、金盏花和白英，已在法国获得许可，并以10g管软膏乳房给药，可用于奶牛体内乳腺功能的恢复。该研究涉及收集和分析来自31个被自动挤奶系统（AMS）感染的乳房区域的数据，以评估Dolisovet®对所选乳腺炎症参数的影响。当牛奶质量开始下降时，通过AMS发出的警报，根据电导率（EC）可识别出乳房炎。从AMS警告开始之日起，连续两天每天2次给予Dolisovet®。第一次治疗后4～7d观察到EC明显降低，牛奶产量也增加了。因此，Dolisovet®在乳腺炎症的早期阶段以及恢复乳腺健康和功能方面可能具有有益的治疗作用。这种药物可能是亚临床牛乳腺炎的有效一线治疗药物，通过对其的应用可以减少对抗生素的需求[34]。

5 未来展望

本文主要综述了7类潜在治疗奶牛乳房炎的抗生素替代物的治疗依据。益生菌已经用于畜牧业，被证明可以提高动物的生长速度、产量和总体健康[35]。因此，在农场运用益生菌进行乳房炎的控制容易被接受和推广。其他抗生素替代物虽目前在临床上运用有限，但均可以被认为是具有潜力的抗生素替代品。在未来，不仅要专注于针对乳房炎病原体的抗生素替代物的发掘，同时要着重于确定确切的作用方式和传递方式，以确保积极应对全球抗生素危机。