细菌III型分泌系统及其效应蛋白致病性研究进展

陆彭磊，蔡少平

近年来，人们发现，细菌为了适应宿主体内的生存环境，更好地在宿主体内生长繁殖，通常需要分泌一些毒力因子或毒力相关性蛋白以创造适宜自身生存的环境。细菌因此进化出许多不同的分泌系统以分泌毒力因子或毒力相关性蛋白[1]。细菌III型分泌系统(Type III secretion system，T3SS)是其中之一。在分泌系统中，与病原体存活及毒力相关的蛋白质称为效应蛋白(effector protein)。细胞凋亡和细胞焦亡(Pryoptosis)是宿主细胞清除致病菌、维持机体稳态的两种主要途径，也是部分革兰阴性菌的 T3SS 效应蛋白操纵宿主细胞死亡的两个主要方面[2]，但是不同的效应蛋白在该过程中发挥的功能不同。随着研究的不断拓展和深入，现今发现T3SS在致病过程不仅具有复杂的分子装置，也是蛋白质的一种运输工具，同时还能反向抑制信号通路，从而调控信号的传递强度。本文就针对T3SS效应蛋白分泌机制进行综述。

1 细菌分泌系统概述

革兰阴性菌有许多分泌蛋白和外露蛋白，但在发育和进化过程中是通过相对较少的分泌机制分泌蛋白的。目前认为的革兰阴性菌分泌系统有9个，I～IX型[3]。其中T3SS是一个多组分蛋白形成的复合体跨膜通道。目前对副溶血弧菌[4]、铜绿假单胞菌[5]等革兰阴性菌的T3SS效应蛋白致病机理和鉴定方法的研究比较广泛。遗传和分子学分析表明T3SS组装和分泌的效应物在蛋白质分泌的过程中起到关键调节的作用。同时作为必需的毒力因子，T3SS是疫苗和治疗的有效靶标[6]。T3SS其结构部件由20多种不同的蛋白质组成，形成基部、细胞外针、尖端复合体和一个易位蛋白[7-8]。Nans A通过用低温电子断层扫描和亚层断层扫描获得沙眼衣原体T3SS的超微完整结构，证实T3SS通过形成类似于泵样的构象变化来与宿主产生联系[9]。由此可见，部分革兰阴性菌在与宿主接触中存在一种跨膜通道用于传输效应物，该跨膜通道的作用和传输方式需进一步通过其与细菌致病的机制结合研究。

2 T3SS分泌系统在细菌致病过程中作用

细菌III型分泌系统是许多革兰阴性致病菌中存在的复杂的分子装置，T3SS通过分泌蛋白将毒力蛋白直接注入宿主细胞以达到致病目的。首先从结构上，T3SS的核心结构包括固定在细菌膜表面的基本结构，这一基本结构由3种蛋白质齐聚成环组成。其中蛋白质SctD和SctJ形成环状组成空心内壁(Inner membrane，IM)，蛋白质SctC形成独立外部环状外壁(Outer membrane，OM)。IM和OM组合形成整个T3SS结构，其中SctD、SctJ和SctC的结构的完整性对于T3SS的活性起到至关重要的作用[10]。同时，Halder, PK研究中将PscN定义为T3SS的ATP酶，将PscL定义为其未表征的调节因子，并指出PscL和PSCN在1∶2的比例下ATP酶活性即可达到80%。因此PscL不仅是PSCN的调节器，并且可以形成三维模型相互作用[11]。所以，T3SS的结构模型完整性在致病过程中起关键作用，同时其中的调节因子也可以调节致病菌注入宿主细胞的程度。可见，T3SS结构完整性使得T3SS可以通过激活酶类活性或特异性抑制酶类活性来达到调控毒力蛋白注入宿主细胞的目的。

与此同时，T3SS作为一种运输工具，通常是通过其跨膜通道的特性，来完成其致病的目的。Cameron EA研究显示，肠道中拟杆菌属T3SS会自身水解从而反向抑制疾病进程，同时通过与肠出血性大肠埃希菌形成一种共生病原体的关系，提供给肠出血性大肠埃希菌适合定植的微环境，帮助肠出血性大肠埃希菌自身内源性蛋白酶在哺乳动物细胞中形成T3SS孔，促进T3SS将毒力因子易位到宿主细胞内，从而引起肠道疾病[12]。Kim SI研究显示沙门菌致病因子编码的细菌III型分泌系统效应蛋白，通过外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMV一种革兰阴性菌释放的球形膜状结构)分泌。鼠伤寒沙门菌可以利用OMV作为运输工具将这种效应蛋白递送到宿主细胞的细胞质中，而不依赖于细菌与宿主细胞的相互作用[13]。

另外，T3SS上基因簇编码和对非致病因子编码的调控也反映出与细菌毒性上的相关作用。张秀彩研究显示当菌株转录调控因子表达水平较高时，效应蛋白编码基因表达水平相对偏低，存在负相关性[14]。Kassa EG通过流式细胞仪的检测和成像技术跟踪感染细胞效应物的动力学和膜运输。发现肠致病性大肠埃希菌效应物控制上皮宿主细胞的内吞和转胞吞。影响了机体内循环机制，使宿主质膜蛋白发生错误定位和富集，这些现象被证实与细菌定植和毒性存在一定的联系[15]。

同时，T3SS可以通过去磷酸化或去乙酰化来促进病原菌的生长。Desveaux研究发现T3SS通过将丁香假单胞菌乙酰转移酶递送到宿主细胞中以促进细菌生长。丁香假单胞菌乙酰转移酶的生物学活性能导致宿主细胞触发其免疫应答。研究结果表明丁香假单胞菌乙酰转移酶可以乙酰化受体细胞质激酶，并通过激酶结构构象改变来促进细菌生长[16]。Dortet L研究显示病原菌在感染早期就已经出现了诱导T3SS去磷酸化和去乙酰化。细菌病原体可以通过影响表位遗传因子来重新编码靶细胞。由易位蛋白操纵组蛋白，形成孔状毒素分泌到细胞外环境中，继而引发病原菌破坏宿主细胞[17]。其次，T3SS中结构部件易位蛋白在转运中也起到了关键作用。George Z研究发现沙眼衣原体可以利用T3SS中的易位蛋白(肌动蛋白招募磷蛋白 the Translocated Actin-Recruiting Phosphoprotein，TRAP)刺激宿主细胞的细胞骨架重组以达到入侵和进行性发展的目的。同时肌球蛋白轻链激酶、TARP低聚和肌球蛋白ATP酶的特异性抑制能显著降低未折叠蛋白应答反应的激活和衣原体的复制[18]。Romano Fabian B研究发现铜绿假单胞菌中的易位蛋白PopB和PopD。PopD在膜中形成六聚体结构，通过与PopB的相互作用，形成一种独特的由8个PopB和8个PopD分子组成的异源寡聚体组装结构蛋白模型[19]。Armentrout E I也从遗传的角度识别到蛋白与蛋白之间接触由易位蛋白形成跨膜通道来完成，其中PopD是必须存在的并且积极参与到易位孔构象改变的易位蛋白[20]。

3 T3SS分泌系统反向抑制作用

细菌分泌系统不仅可以通过调控其通道的输送功能完成其毒力作用，研究发现缺失部分毒力相关致病因子也会影响感染发病。赵凯英研究显示T3SS有助于致病菌在组织中大量增殖，其中如果迟缓爱德华菌缺失eseC基因，可影响效应蛋白分泌到宿主细胞内发挥效应，影响了迟缓爱德华菌的致炎作用[21]。另有研究发现在T3SS中，沙门菌致病因子可以阻止主要组织相容性II类复合物通过沙门菌感染抗原提呈给宿主细胞[22]。原因之一是缺失编码分子伴侣对致病产生了直接影响，另外磷脂酰胆碱缺失也影响膜蛋白在细胞膜内的转运和组装，最终导致组装后的T3SS装置不能正常发挥T3SS的跨膜转运功能[23]。

其次，在T3SS跨膜转运中将转运蛋白的组装进行一定的构象改变，也会对蛋白转运过程形成一定的影响。Tang Y研究发现铜绿假单胞菌中的转运蛋白在膜中组装成二聚体，形成特殊构象后，可将编码N`末端区域暴露于宿主细胞中，利于功能性蛋白与宿主接触[24]。Belyy A研究发现铜绿假单胞菌分离株含有ExoY变体，其突变改变了该效应子的C`末端。这些天然存在的ExoY变体表现出显著降低的酶活性和毒性的作用[25]。因此可以看出T3SS缺失部分关键性编码分子、关键酶类或形成构象改变可以影响其毒力的输送功能。

4 T3SS分泌系统的竞争和协同作用

外膜蛋白在T3SS系统中也起到了一些间接作用。Chowdhury R研究显示外膜蛋白协同T3SS使小鼠伤寒菌致病，外膜蛋白可以粘附在T3SS的粘连蛋白层来达到间接入侵宿主的目的[26]。同时细胞中的外膜蛋白通过其自身的20个氨基酸与酪氨酸激酶相互作用，抑制酪氨酸激酶活性以限制体内伤寒沙门菌的肠道入侵和全身感染[27]。可见外膜蛋白可以通过T3SS对细菌的致病起到间接的影响。

5 T3SS分泌系统的人为干预和相关药物应用

现阶段的研究显示靶向抑制剂可以通过关闭3型分泌蛋白分泌的高度抗原性蛋白质来清除和关闭志贺氏菌的免疫记忆的呈现，这项研究也给用非菌药物疗法对抗T3SS的ATP酶提供了可能性[28]。也有研究显示5种植物的乙醇提取物(三叶鸡矢藤、布奇汉姆属、杨梅竹柏藤、榄仁黄花菜、百里香属和甜樟属)对T3SS中的蛋白质有抑制鼠伤寒沙门菌活性的作用，同时显示夏枯草对金黄色葡萄球菌有很强的抗菌活性可能也与T3SS系统有关[29]。可见药物对T3SS也有关闭T3SS蛋白分泌通道和消除免疫记忆的呈现来抑制细菌活性的作用。

6 总结与展望

综上，T3SS与细菌运输毒力因子或毒力相关性蛋白息息相关。T3SS通过形成复杂的分子装置作为运输工具。同时通过去磷酸化或去乙酰化促进病原菌的生长，通过分子装置结构构象改变影响细菌的毒力作用。T3SS组装件之一易位蛋白也对转运起到了关键作用，同时基因表达的缺失也能一定程度影响T3SS的转运。其次，药物应用上有部分药物甚至像夏枯草等中药在抗菌活性上也可能与T3SS有关。在实际应用中，有文献显示肠出血性大肠埃希菌和肠致病性大肠埃希菌T3SS分泌的EspY3(一种新的非致病因子编码的肠出血性大肠埃希菌T3SS效应物)与沙门菌的效应蛋白具有同源性[30]。还可以使用基因组的生物信息学预测工具来分类检索革兰阴性菌中T3SS的基因，以增大细菌致病基因的检出率[31-32]。对T3SS分泌系统的药物干预为临床通过非抗菌药物疗法或研究新型抗菌药物提供了理论依据，同时用基因组学的检索工具来分类T3SS基因组的生物学信息也进一步加大了细菌致病基因的检出效率。

T3SS在细菌胞质分泌过程中起到了起承转合的作用，对于了解细菌毒性和预测临床预后具有重要的意义。T3SS作为分泌蛋白，具有分泌蛋白性质毒力因子的能力，是革兰阴性菌相对较少的几种分泌机制之一，也是革兰阴性菌为了适应其在宿主细胞内生存环境，而向外分泌的具有重要功能的蛋白。细菌分泌系统在近年来细菌致病机制研究中进展迅速，并且成为新的耐药性研究热点。希望本文能为制定和研究T3SS在宿主细胞中的作用机制提供参考依据。

利益冲突：无