死亡结构域蛋白Daxx与DNA病毒蛋白相互作用及影响的研究进展

丁 霜，唐双阳，杨晓东，申海艳，万艳平

死亡结构域蛋白(Death domain-associated protein，Daxx)[1]是一种多功能蛋白，可与胞内蛋白或病毒蛋白相互作用，从而参与细胞凋亡、转录调控、抗病毒感染等。正常情况下，Daxx是早幼粒细胞白血病蛋白核体(PML nuclear bodies，PML NBs)的恒定驻留蛋白，它常与早幼粒细胞白血病蛋白(Promyelocytic leukemia，PML)、转录抑制因子Sp100及其它蛋白构成PML NBs的球形结构并维持其稳定性[2-3]。但当DNA病毒在核表达后，DNA病毒能以PML NBs为靶点使其被拆解并重组，导致Daxx不能正常定位于PML NBs而有利于病毒基因的转录调控、复制并支持感染的建立[2]。不仅如此，某些DNA病毒还可表达相应蛋白与Daxx相互作用，对病毒基因的表达产生影响。近年来国内外研究人员对人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)、人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)等DNA病毒及其表达蛋白之间的作用做了较多研究和探索，本文主要综述近年来Daxx与不同DNA病毒蛋白相互作用及影响的研究进展。

1 Daxx与人腺病毒蛋白

HAdV早期1B区55-kDa蛋白(Early region 1B 55-kDa protein，E1B-55k)是一种多功能磷酸化蛋白，它能降解宿主细胞蛋白、输出病毒晚期mRNA、抑制p53介导的转录等，在腺病毒感染过程中起关键作用[4]。在E1B-55k蛋白早期表达时，它能以依赖小泛素样修饰(small Ubiquitin-like modifier，SUMO)的方式抑制染色质重塑因子Daxx[5]。其中，Daxx可抑制高效HAdV的感染，但这种抗病毒反应可被HAdV E1B-55k蛋白经多种途径中和[6]。当Daxx与α地中海贫血/X连锁智力低下综合症蛋白(X-linked α-thalassemia/mental retardation syndrome，ATRX)染色质重塑复合物抑制HAdV复制时，E1B-55k蛋白可与早期4区开放阅读框蛋白6(Early region 4 open reading frame protein 6，E4 ORF6)组装成E3泛素连接酶样复合物，协同抑制Daxx，并启动蛋白酶体拮抗ATRX，从而促进病毒基因表达[7]。近年也有研究表明，E1B-55k蛋白可与宿主蛋白酶体形成新的降解途径降解Daxx。该降解途径主要通过E1B-55k招募指环蛋白4(RING-finger protein 4，RNF4)并形成复合物抑制Daxx的功能，且该途径独立于经典的HAdV E3泛素连接酶复合物[6]。其中，RNF4属于SUMO靶向泛素连接酶(SUMO-targeted Ubiquitin ligases，STUbL)蛋白家族成员[8]，一方面，它能促进E1B-55k介导对Daxx的抑制作用；另一方面，它可被E1B-55k招募到感染细胞的不溶性核部分与Daxx相互作用，共同促进Daxx的翻译后修饰(posttranslational modification，PTM)，抑制Daxx这一抗病毒因子的功能[6]。Li Q等研究发现在卵巢癌细胞中E1B-55k蛋白能与Daxx结合，并诱导Daxx的降解[4]。其中，E1B-55k能增强顺铂对卵巢癌细胞的毒性，且Daxx的表达与卵巢癌的耐药表型相关。在对顺铂敏感的卵巢癌细胞中，E1B-55k可通过介导Daxx降解激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)Caspase3和Caspase8外源性凋亡信号通路，从而诱导细胞凋亡。同时，当通过E1B-55k降低Daxx的表达或通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)敲除Daxx时，卵巢癌细胞和肿瘤标本可增加对顺铂的敏感性[4]，这表明Daxx在卵巢癌细胞中具有凋亡相关功能。此外Kang S等人研究发现，只有当Daxx由于E1B-55k降解时，才能有效的维持腺病毒的复制。因此，当采用不表达E1B-55k的溶瘤腺病毒作为基因递送工具时，将引起Daxx沉默[9]。

HAdV E4 ORF3具有SUMO E3连接酶的功能，它可直接促进多种细胞蛋白与SUMO的结合及细胞蛋白的重新定位。在被感染的细胞中，只有靶蛋白招募到E4 ORF3聚合体时，才可发生SUMO修饰[10]。不仅如此，在干扰素(Interferon，IFN)诱导抗病毒感染期间，HAdV DNA的复制也需要E4 ORF3蛋白的存在。Ullman AJ等人用短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)干扰人纤维肉瘤HT1080细胞内Daxx表达时，E4 ORF3突变株的复制可恢复到未受刺激细胞中所观察到的水平。表明在E4 ORF3蛋白拮抗IFN诱导的抗病毒应答时，IFN诱导抗病毒效应物即Daxx抑制E4 ORF3突变株的复制。但有趣的是，IFN诱导的抗病毒状态对HAdV早期基因转录的影响并不大[11]。且HAdV E4 ORF3蛋白可通过重组PML NBs，重新定位PML和Daxx，破坏与靶蛋白相关的抗病毒特性[12]。其中，PML将重新定位为类似于核纤维的结构[13]。HAdV E4 ORE3蛋白通过拮抗PML和Daxx介导的先天性抗病毒反应，对病毒的后续表达产生积极影响[11]。另Freudenberger N等人发现，在感染过程中，衣壳蛋白VI也可通过调节转录因子Daxx调节抗病毒反应[14]。以上表明，Daxx与HAdV E1B-55k、HAdV E4 ORF3等蛋白直接或间接作用，抑制或促进抗病毒效应的发挥。

2 Daxx与人巨细胞病毒蛋白

HCMV 被膜蛋白pp71(Phosphoprotein 71，pp71)是一种主要的病毒反激活磷酸蛋白，当其被释放进入细胞时，它能激活HCMV主要即刻早期启动子(Major immediate-early promoter，MIEP)启动病毒转录，对HCMV裂解复制周期的启动具有重要作用[15]。研究表明，在HCMV感染期间，PML NBs驻留蛋白可沉默病毒即刻早期(Immediate-early，IE)基因的表达。PML、SP100是IFN-β抗病毒活性的关键调节因子，但Daxx不能降低IFN-β的抗病毒能力[16]。而在IFN-β背景之外，Daxx是细胞内防御抑制HCMV IE转录的组成部分，Daxx可通过招募组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDACs)至MIEP周围，形成由组蛋白特异性翻译修饰产生的抑制性染色质结构，沉默MIEP介导IE基因表达的下调[6，17]。但这种抗病毒机制能被pp71被膜蛋白有效中和[17]后，病毒即刻早期基因表达将得以促进。pp71被膜蛋白主要通过以下两条途径缓解MIEP的沉默，从而拮抗Daxx对病毒表达的抑制作用：1)与Daxx相互作用定位于PML NBs导致Daxx沿蛋白酶体降解；2)与Daxx结合诱导其SUMO化修饰[15，18]。研究表明，在pp71介导Daxx降解时，需要20S核心颗粒(Core particle，CP)和19S调控颗粒(Regulatory particle，RP)的参与[19]。而在Daxx被降解之前，ATRX与Daxx结合并定位于PML NBs，其中ATRX也是细胞内防御抑制HCMV IE转录的组成部分。但细胞感染HCMV后，pp71可将与Daxx结合的ATRX从PML NBs中置换出来，并将其分散至细胞核中，从而缓解Daxx、ATRX对IE基因表达的抑制作用，这对HCMV病毒基因表达的有效启动十分重要[20-21]。值得一提的是在未分化的人急性单核细胞白血病细胞THP-1感染HCMV后，经shRNA介导Daxx、PML、Sp100蛋白的缺失不会影响病毒IE基因表达的启动。但当其向巨噬细胞分化后，PML NBs驻留蛋白的缺失可引起启动病毒基因表达细胞数量的显著增加。当Daxx缺失时，其增强作用远超其它蛋白，约为另外两种蛋白的20倍[17]。该现象表明Daxx、PML和Sp100是IE基因表达的制约因素，但与HCMV潜伏期的建立关系不大。

HCMV IE1蛋白也称IE72蛋白，在pp71降解过程中其正反馈能维持MIEP的表达[15]。它可通过与PML相互作用拮抗PML NBs驻留蛋白引起的沉默，且与pp71拮抗MIEP沉默作用的机制不同[22]。不仅如此，当感染复数(Multiplicities of infection，MOIs)较低时，该蛋白对HCMV的有效裂解感染具有重要意义[15]。Poole EL等研究表明，延迟相关基因产物LUNA(Latency unique natural antigen，LUNA)为一种半胱氨酸蛋白酶，具有脱羧酶的活性，它可提高病毒再活化的效率。在HCMV再活化早期，其病毒活性可引起IE基因的强烈表达，这将对病毒再活化下游产生影响[23]。在HCMV裂解感染阶段，IE1蛋白能介导LUNA启动子的激活[24]。其中，LUNA在HCMV潜伏期、细胞裂解期均可表达，但Daxx能依赖ATRX抑制LUNA基因的表达[24]。不仅如此，HCMV潜伏期PML NBs的扩散对LUNA具有依赖性。但LUNA可通过其脱羧酶活性，在潜伏期消除细胞中潜在抗病毒的PML NBs结构[23]，因此处于潜伏期的HCMV可通过其编码的LUNA有效的重新激活。有趣的是，IE1可通过直接的物理作用抑制Daxx与LUNA启动子的特异性结合，从而阻止Daxx对LUNA表达的抑制作用。该物理作用包括IE1与Daxx的相互作用及IE1与HDACs相互作用激活LUNA基因的表达。

3 Daxx与人乳头瘤病毒蛋白

HPV E2、E6蛋白是HPV的早期表达蛋白，能与细胞蛋白或转录因子相互作用，参与细胞凋亡、病毒基因复制和转录、诱导细胞恶化等[25]。其中E2蛋白是病毒在细胞内进行复制所必需的，它能招募DNA解旋酶E1到复制起始点并定位于HPV复制中心，且能不依赖PML与部分Daxx发生共定位[26]。研究表明，Daxx能与HPV16 E2蛋白在人宫颈癌Caski细胞内外结合，并共定位于胞浆与胞核[27]，且E6蛋白也可与Daxx共定位并影响其功能[28]。E6蛋白可抑制人宫颈癌HeLa细胞的凋亡，但Daxx高表达时，E6蛋白的抑制作用会发生下调。在转染HPV16 E6的HeLa细胞中，E6蛋白可使核内部分Daxx转位至细胞浆[28]。而Daxx位置的转移，势必对其本身及病毒基因的表达造成一定影响。

在病毒感染早期，HPV晚期表达蛋白L2能促进病毒基因组入核聚集于PML NBs启动病毒转录，招募L1至PML NBs与病毒基因组一同完成病毒的组装，其存在可促进HPV病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)的高效组装及核定位，有利于HPV病毒的感染[29]。Florin L等通过免疫共沉淀等方法证明，HPV L2蛋白可直接或通过中介体与Daxx发生相互作用，并诱导PML NBs重组改变其蛋白组成。在L2存在的条件下，L2能与Daxx共定位并诱导其进入PML NBs发生大量聚集。至于L2通过何种机制招募Daxx，仍需进一步的研究和探索。

在被HAdV、HCMV感染后，Daxx能抑制病毒基因表达产生抗病毒反应。在HPV感染中，Daxx也能影响HPV基因组的转录和调控。在人成骨肉瘤U2OS细胞中，它可调节HPV基因组早期基因的表达和瞬态复制。Daxx正常表达时，HPV基因组在U2OS细胞中具有转录活性，但当Daxx被敲除后，HPV DNA病毒早期基因转录表达降低。Kivipold P等通过干扰Daxx RNA下调Daxx表达，发现病毒DNA的复制降低了2～3倍[26]，且在原代人角质形成HFKs细胞中，敲除Daxx也可导致HPV病毒转录及病毒DNA复制的降低[30]。

4 Daxx与其它疱疹病毒蛋白

在Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)感染时，Daxx可与ATRX相互作用形成复合物，并以一种类似于在HCMV中的方式参与细胞对HSV-1感染的内在防御，但HSV-1立即早期蛋白ICP0可以抵消这种抗病毒作用[31-32]。其中，ICP0为病毒及细胞基因转录的积极调控因子，而携带病毒DNA的PML NBs(viral DNA-containing PML NBs，vDCP NBs)含有Daxx和ATRX，因此这两种成分可能参与HSV-1基因的染色质化及保持已染色质化的HSV-1基因[33]。另有研究表明，HSV-1立即早期蛋白ICP27也可与Daxx结合，抑制Daxx的SUMO化，提高Daxx从胞核至胞质的易位，并增强Daxx所介导的p65去乙酰化，从而抑制NF-κB的转录活性[34]。

在卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s Sarcoma Associated Herpesvirus，KSHV)潜伏感染期间，需依赖潜伏期相关核心抗原(Latency Associated Nuclear Antigen，LANA)维持病毒附加体的稳定。其中，LANA是一种形成寡聚体的结构，该结构本身及其形成的聚集结构均可与Daxx发生共定位。当Daxx在LANA核体中时，能对大型复合蛋白和核酸复合物的形成及稳定产生促进作用[35]。

恒河猴疱疹病毒(The rhesus monkey rhadinovirus，RRV)与KSHV密切相关，它主要以降解Sp100等途径避免PML NBs介导的抑制作用，但仍受Daxx的限制。当Daxx被敲除后，RRV感染及复制将显著增加[36]。

与KSHV同属γ疱疹病毒家族的EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)可编码主要被膜蛋白p140即BNRF1蛋白，该蛋白可刺激ICP0缺失突变型HSV-1和pp71缺陷型HCMV病毒的复制[21]，也可破坏ATRX-Daxx的相互作用。且BNRF1能与Daxx-H3.3-H4结合，对BNRF1定位到PML NBs及EBV潜伏期选择性病毒基因表达至关重要[37]。

5 Daxx与其它病毒表达蛋白

除了以上所提及的病毒蛋白，Daxx还能与其它病毒蛋白相互作用。最近有研究表明，杆状病毒可表达反式激活蛋白IE2，它能通过Daxx与病毒DNA相互作用，形成一个新的核体作用于非洲绿猴肾细胞Vero基因的激活。当杆状病毒转导Vero E6细胞时，Daxx与组蛋白H3.3可捕获病毒DNA导致基因失活。在转导早期，IE2可通过SUMO化作用基序形成独特的核体结构。该结构的形成依赖Daxx，可逐渐增大引起病毒活化。即IE2可通过Daxx/H3.3复合物有效靶向病毒DNA并激活。存在IE2的转导后期，Daxx和H3.3可与病毒DNA分离[38]。

虽然Daxx能与许多病毒蛋白作用并产生影响，有研究认为在梅克细胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCPyV)感染时，Daxx对MCPyV DNA复制并无影响，因病毒复制的负调控因子为Sp100[39]。

6 展 望

DNA病毒感染可引起多种疾病，某些病毒可导致恶性肿瘤甚至引发死亡。目前，虽已明确Daxx能与一些DNA病毒的表达蛋白相互作用，如人腺病毒的E1B-55kDa及E4 ORF3蛋白、人巨细胞病毒的pp71及IE1蛋白、人乳头瘤病毒的早期及晚期表达蛋白等。但在不同DNA病毒感染时，Daxx对病毒基因表达所起的作用并不一致。而当Daxx与病毒蛋白发生相互作用时，将对Daxx的功能及病毒基因的表达造成某些影响。因此，仍需进一步研究并探索Daxx与各种DNA病毒及其表达蛋白间的相互作用，以确定Daxx对致病病毒表达是否起作用、能否与病毒基因表达的蛋白发生相互作用等，这对预防DNA病毒的感染及治疗有一定的意义。

利益冲突：无