新型冠状病毒的核酸检测及安全防护

黄鹏飞(中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300309)

0 引言

2019年12月新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)引起的新型冠状病毒性肺炎(COVID-19)在湖北省武汉市蔓延。在疫情爆发的早期，高通量测序是检测病毒的主要手段，但是该检测技术费用昂贵，检测时间长并且对仪器和操作员提出了很高的要求，无法满足大规模快速检测需求。实时荧光定量RNA 反转录与cDNA 聚合酶链式扩增相结合的检测技术的应用基于国内外大流行病的经验，可以高效、快速地完成病毒标本的检测，具有高灵敏度、高特异性、易于推广的优点，因此成为我国疫情防控的首要检测手段。本文结合实践对荧光定量RNA 反转录与cDNA 聚合酶链式扩增相结合的检测方法的应用进行探讨，并提出了生物实验研究、手术护理过程中的安全防护措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例来源

2020年2月15日至2020年3月15日我院发热门诊室收治的763 位发热患者。

1.1.2 试剂与仪器

试剂选用上海源叶生物科技有限公司生产的核酸提取试剂盒和新型冠状病毒核酸检测试剂盒。检测仪器选用Bio-Rad伯乐 CFX Connect 荧光定量PCR 仪。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

预约采样，每日上午、下午分别采集一批样本，由穿戴三级生物安全防护装备的医护人员采集患者的咽拭子，对于多次咽拭子检测为阳性或高度疑似的患者，进一步采集痰液或肛门拭子。

1.2.2 样本包装、运送及接收

收集样品后，将其放入病毒存储管中并冷冻，试管外贴条码。用75%的乙醇喷洒样品管后放在密封袋。每个包装仅限存放一个样品管。样本由专门人员送到实验室。接待人员对箱子的外表面进行消毒，用75%的乙醇喷洒运输样品运输箱表面，将其打开再对箱子进行乙醇消毒。最后，取出样品运输箱并在生物安全柜中打开，检查样品数量是否正确，样品管是否完好，有无破损泄漏。

1.2.3 提取样本核酸

通过磁珠法提取核酸RNA，为扩增核酸，使用新冠病毒开放阅读码框(ORF1ab)和基因编码核衣白核蛋白(N)基因特异性保守序列为靶区，构建双靶基因。与PCR 反应溶液结合使用可以通过在定量PCR 荧光仪上改变荧光信号来进行RNA 检测。

1.2.4 检测结果分析

实验中使用的PCR 检测系统包括内源内标(IC)引物，可通过确定正常内标来监控样本采集、核酸提取及扩增情况，有效减少假阴性检测结果。在每个批次的实验中建立三个阴性质量对照和一个关键的阳性质量对照，将它们随机插入样品中同时检测，以监控实验结果的可靠性。分析结果时应首先检查阴性和阳性质量控制结果，阴性质量控制品的FAM 和ROX 通道都没有Ct 值或Ct 值大于40，阳性质量控品FAM，ROX 通道和内标通道HEX 的Ct 值小于等于35。如果质控产品的结果满足上述要求，则实验结果有效，否则结果无效，需重新测试。

每个测试样品的结果应参考试剂盒说明，分析结果如下：(1)如果FAM 或ROX 通道检测出典型S 型扩增曲线，Ct 值小于等于40，可以报告为样品中SARS-CoV-2 核酸阳性。(2)如果FAM和ROX 通道都未测得典型S 型扩增曲线，无Ct 值或Ct 值大于40，HEX 通道测得S 型扩增曲线，Ct 值小于等于40，则样本可以判断为SARS-CoV-2 样本核酸阴性。(3)如果FAM、ROX、HEX通道均未测得典型S 型扩增曲线，且没有Ct 值或Ct 值大于 40，则表示样本细胞含量低或反应被抑制，样品测试结果无效，需找到原因并消除，重新测试。

2 检测过程中的安全防护

2.1 标本采集过程中的安全防护

核酸检测样品包括上呼吸道样品(如口咽拭子，鼻咽拭子等)，下呼吸道样品(如痰液、呼吸道提取物、肺泡灌洗液等)，患者病症发作期间的血液、粪便。收集样品时应该确保收集者配备生物安全三级防护设备。据统计最常用的咽拭子样本核酸检测准确率、灵敏度较低，下呼吸道样本检测则阳性率偏高。比较理想是检测患者痰液，建议使用6 mL，3%生理盐水雾化吸入20min，从下至上轻拍患者背部促使痰液排出。对于无法采集痰标本的患者仍需要用咽拭子检测核酸，但应考虑影响核酸检测的因素例如采集材料、采集深度等。

2.2 样本转运过程中的安全防护

收集样品后，样本试管外部用75%的乙醇喷洒消毒，将其放在专用双层一次性密封袋中，再用75%的乙醇喷洒密封袋外表后将其放在转运箱(带有生物安全标志)中，对转运箱进行消毒并立即送交检查，整个过程必须在两个小时内完成。工作人员随身携带75%的乙醇以应对突发事件。新冠病毒肺炎临床实验室检测生物安全防护指南指出在发生突发事件时转运工作人员不可自行处置转运箱，而应与接收地点联系以说明情况并与接收人员协调处理。建议转运人员应该随时携带75%乙醇，如果运输箱的密封件发生损坏可以立即进行紧急消毒处理，如果样品泄漏，请到接收处与接收人员共同处理。

2.3 样本接收过程中的安全防护

样本接收人员应配备二级生物安全保护装备。在对样品进行双重签名验收操作后，接收人员要用75%乙醇对转运箱的外表面进行喷洒消毒。然后将其静置20 分钟左右，轻轻开启转运箱，再次用75%乙醇对转运箱的内部、密封袋进行喷洒消毒。重点检查样本转运过程中是否发生泄漏，以及核对样本来源信息是否正确，如患者个人信息，然后将样本放入储藏盒中，并在4℃专用冰箱中进行存储，存储时间不能大于24h。对于血浆样本可以在4℃下最长存储3 天，在-20℃下可以长期保存。应当记录样本收集、转运、接收环节的信息，以方便进行跟踪。

3 医护过程中的安全防护

3.1 手术间的安全防护

要严格按照治疗传染病的相关程序，新冠病毒肺炎患者或疑似病例正在接受手术时，手术室应是充分消毒的负压手术室，负压前后室门禁止和手术间门同启。手术完成后要关闭负压，并消毒。

3.2 医护人员、患者的个人安全防护

3.2.1 提高医护人员防护意识

通过一定的措施强化医护人员对新冠病毒的安全防护意识，使其可以主动进行安全发防护，积极学习安全管理规章制度，包括手卫生、医疗废弃物处理、消毒和隔离系统、标准化安全防护装备穿戴和拆除、使用负压手术室操作、清洁通道的位置布局。

加强医护人员穿戴和脱除安全防护装备的培训，确保医护人员掌握防护装备的穿脱方法。

在手术前医护人员要做好自我检查，如果发现双手有皮肤损伤，应避免参加手术。如果必须参与手术则应该受到特别保护。在新冠病毒肺炎患者手术过程中，如果医护人员身体处于抵抗力较低的时期，则禁止上手术台。

3.2.2 合理排班保证医护人员体力

合理安排医护人员工作，对孕妇、哺乳期妇女，原则上不安排参加新冠病毒患者手术。创建具有内部和外部明确分工的护士和麻醉师。内部巡查护士、洗手护士、麻醉师主要负责对手术室中的患者进行治疗护理，手术期间禁止越过规定区域以减少污染物扩散。外部巡查护士、外部麻醉师主要负责产品和药品的供应。平时要保证医护人员的休息时间，加强营养。

3.2.3 规范转移患者

在将患者送入送出手术室的过程中，为尽量减少患者转移过程中的污染，因该给意识清醒、呼吸受限的患者佩戴口罩。气管插管患者气管导管接口应连接病毒细菌过滤器，整个过程使用密封式转运车转运。

3.2.4 做好手术中的防护

在开始手术之前，医护人员必须采取适当的防护措施，都应穿着防护服，佩戴N95 口罩、医用手套，还应穿鞋套。手术完成后严格按照规定在指定位置脱下防护服，以免造成二次污染。必须严格遵守手术无菌原则、消毒隔离要求进行严格消毒。

3.3 终末消毒

环境与物体表面消毒。清洁人员也要穿戴标准化防护装备，用1mg/mL 氯消毒液擦拭物体表面。

手术室内物品消毒。被血液或其他分泌物沾染的物品必须用含2mg/mL 氯的消毒布擦拭，其余的要用含1mg/mL 的消毒布擦拭，然后再用清水擦拭。手术室的地板和墙壁上有血迹或分泌物，必须喷洒2mg/mL 的含氯消毒剂并浸泡0.5h 后再用清水擦拭，其余地板、墙壁、天花板要用1mg/mL 的氯来擦拭。

手术室消毒，打开负压层流0.5h，然后关闭层流，并使用含3%过氧化氢的蒸汽熏蒸喷雾剂对手术室中的空气进行消毒，再密闭两个小时后打开层流通风流动并用清水擦拭物品表面以防腐蚀。

4 结语

通过分析新冠病毒检测样本的收集、转运、接收、核酸提取过程中应注意的问题，提出了明确的检测依据，对于确保新冠病毒核酸检测结果的准确性有其重要作用，同时探讨了样本收集、转运、接收中及医护过程中的安全防护。目前，对于COVID-19 的发病机制、临床发病过程、治疗方案仍在持续研究中。作为一种诊断方法，病毒核酸检测仍是一种快速、可靠、必不可少的检测方法。为了进一步提高核酸检测的准确度和速度，需要提高检测试剂盒的稳定性。目前很多研究人员还在积极探索更有效的检测方法，例如数字PCR，这将有助于更快、更准地检测新冠病毒，在控制疾病进程、实现早发现、早治疗以及有效预防控制疫情中起到非常关键的作用。