钠钾ATP 酶活性与癫痫发作的研究进展

2020-01-14杜孙兵杨文秋韩雁冰

中国比较医学杂志 2020年5期

杜孙兵,杨文秋,吴倩,韩雁冰

(昆明医科大学第一附属医院神经内科,昆明 650032)

癫痫是一种反复癫痫发作、脑电图异常放电为特征的慢性脑部疾病。目前全世界约有1%的人患有癫痫,其中约三分之一的患者耐药,即使长期服多种药物仍无法控制发作,给患者及其家庭造成极大困扰,世界卫生组织已把癫痫列为世界五大神经精神疾病之一[1-2]。鉴于癫痫高耐药率和严重危害,迫切需要寻找新的抗癫痫药。近年来研究发现,钠钾ATP 酶(Na+,K+-ATPase,NKA)与癫痫发作密切相关,尤其活性改变可影响癫痫易感性,可能是潜在的抗癫痫治疗靶点。本文将从NKA 分型、分布、功能,及其与癫痫的关系,可能参与发病和调控机制等方面逐一综述。

1 NKA 的功能、组成及分布

NKA 是P 型离子转运ATP 酶中最重要的成员,是哺乳动物细胞膜上普遍存在的跨膜蛋白。NKA 又被称为钠钾泵,负责把分解三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)获得的能量用来完成影响Na+、K+离子的主动转运,将细胞外相对细胞内较低浓度的钾离子送进细胞,并将细胞内相对细胞外较低浓度的钠离子送出细胞,对维持细胞的静息电位、调节神经元兴奋性至关重要[3-4]。 NKA 由α、β 和FXYD 亚基组成。 α 亚基为催化亚基,由十个跨膜螺旋片段组成,是Na+、K+离子的结合位点。 α亚基有三个胞质结构域:核苷酸结合结构域,磷酸化结构域和激动结构域[3],分别由ATP1A1-A4 基因编码,对应α1-α4 四个亚型:α1 在各组织细胞广泛表达；α2 主要表达在脑、心脏、肌肉等；α3 主要分布于脑、视网膜、心脏等；α4 主要在睾丸中表达。在脑内的NKA 的三个α 亚型分布的细胞不同:α1 在神经元、胶质细胞均有表达,α2 主要分布在星形胶质细胞,而α3 主要存在神经元内[3,5-6]。 β 亚基由一个跨膜片段及一个高度糖基化的胞外域组成,有β1-β3 三个亚型,β1 存在于各类组织,β2 分布在脑、软骨、表皮和心脏,β3 存在于脑、表皮、肺、软骨。 β亚基主要功能为辅助新合成的α 亚基正确折叠、靶向和插入到细胞膜[3],并稳定α 亚基构型及调节其活性[7]。 FXYD 蛋白家族为7 个单个跨膜区段伴或不伴信号肽的短多肽,分为FXYD1-7,具有组织特异性表达,在脑组织主要表达FXYD1、FXYD6、FXYD7,通过调节NKA 与底物的亲和力及其最大反应速度来发挥作用[8]。

2 NKA 与癫痫的关系

多方面的证据显示NKA 与癫痫密切相关,尤其是NKA 活性变化与癫痫发作互为因果。一方面,癫痫发作可导致NKA 活性下降。动物发生癫痫持续状态后NKA 活性下降[9-11],癫痫患者脑组织内NKA 活性也显著降低[12]；另一方面,NKA 活性改变也可能引发癫痫。 Atp1a2 突变鼠的癫痫易感性升高[13-14]；通过杂交技术敲除Atp1a3 基因的胎鼠在围生期出现自发性癫痫发作[15]；在小鼠敲入E815k 或D801n 使NKAα3 功能障碍后,出现自发的癫痫发作[16-17]；此外,已在癫痫患者发现有ATP1A3 单基因突变[17-19]。 Atp1a3 或ATP1A3 突变可导致NKA 活性降低,进而导致膜去极化,神经元兴奋性增加[17,20-21],且敲入D801y 导致α3 表达量异常,导致癫痫发作阈值下降[21]。

然而,如果提高NKA 活性是否就减少癫痫发作或降低易感性呢? Funck 等[9-10]首先采用NKA 激动剂DRRSAb 使发生癫痫持续状态后小鼠海马组织中降低的NKA 活性恢复正常,再予戊四氮点燃,发现实验鼠的潜伏期明显延长；然而,给正常小鼠使用DRRSAb 升高NKA 活性,再予戊四氮后小鼠癫痫发作加重。因此,要抑制癫痫发作,仅能把NKA活性调控在一定范围内,并非NKA 活性上调越高,对癫痫控制越好。

3 NKA 参与癫痫发病的机制

癫痫发作是由于脑内神经细胞的兴奋性过高而抑制功能削弱所致,与离子通道、神经递质、能量代谢及神经胶质细胞异常密切相关。 NKA 不仅在脑内神经元、星形胶质细胞表达,还参与调控神经细胞离子转运、重要兴奋性神经递质谷氨酸和抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的代谢,以及能量代谢等[22-23]。

3.1 NKA 与离子平衡

神经元内的NKA 通过利用水解ATP 释放的能量维持细胞内外电化学梯度来维持其兴奋性。抑制NKA 活性,将导致胞内Na+增高,胞外K+蓄积,广泛膜去极化,膜兴奋性增加,癫痫发作[24]。此外,NKA 所形成的Na+、K+浓度差又可诱发Ca2+、Cl-、H+、谷氨酸、GABA 以及葡萄糖等转运[25]。因此,NKA 激活后可产生神经元动作电位后超极化电流,而导致癫痫发作终止或癫痫易感性下降[26]。

3.2 NKA 与谷氨酸代谢

谷氨酸是脑内主要的兴奋性神经递质,谷氨酸在兴奋性突触中的转运依赖于谷氨酸转运体(excitatory amino acid transporters, EAATs)。 EAATS利用NKA 所形成的钠钾电化学梯度作为驱动力[25],每转运入1 分子谷氨酸的同时,伴随1 分子K+排出到胞外和3 分子Na+、1 分子H+进入到胞内。胞内Na+浓度升高,激活NKA,其中EAAT1、EAAT2特异性表达在星形胶质细胞,而其余EAATS 表达在神经元上[27]。当NKA 功能障碍时,可导致谷氨酸清除障碍,甚至反向转运出胞外。生理情况下,谷氨酸转运入胞内后,在星形胶质细胞表达的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)作用下转化为谷氨酰胺,而GS 活性同样受胞内Na+浓度调控[25]；生成的谷氨酰胺在分布于星形胶质细胞的谷氨酰胺转运体(system N transporter 1,SN1)作用下进入细胞外空间,而SN1 转运谷氨酰胺的方向由Na+电化学梯度和谷氨酰胺的浓度差决定。在细胞外空间的谷氨酰胺由谷氨酰胺转运体SAT1(system A type glutamine transporter 1)、 STA2 ( system A type glutamine transporter 2)分别转运至GABA 能和谷氨酸能神经元内。谷氨酰胺在神经元内转化为谷氨酸。在谷氨酸能神经元内谷氨酸被囊泡转运体转运入囊泡储存。因此,当NKA 活性下调后,胞内Na+蓄积,谷氨酸释放增加,谷氨酸清除减少,胞外谷氨酸蓄积[28]。

神经元释放谷氨酸的主要方式具有钙依赖性。静息状态下,神经元外Ca2+浓度约为细胞内的1 万倍,而要维持这种Ca2+胞内外浓度差除经内质网上钙泵、线粒体上Ca2+单向转运体将钙回收入钙库外,Ca2+运出胞外还主要涉及质膜钠/钙交换体(Na+/Ca2+exchanger； NCX)与质膜钙泵这两个方式。前者负责主要Ca2+大量外排,后者负责Ca2+外排细微调节。 NCX 存在两种工作模式,正向模式是NCX利用Na+浓度梯度作为驱动力,3 个Na+进入胞内的同时将一个钙离子转运出胞外[29]；反之为逆向模式。 NCX 正向模式依赖于NKA 的钠钾电化学梯度,当NKA 活性异常时,可导致钠钙交换效率下降,甚至逆转为反向模式[30],胞内Ca2+蓄积[31],触发突触谷氨酸大量释放,胞外谷氨酸蓄积。胞内Ca2+过多,可抑制α2、α3 型NKA 活性,而NKA 活性下降或丧失可导致胞内Ca2+蓄积,形成一个正反馈机制[32]。

3.3 NKA 与GABA 代谢

GABA 是哺乳动物脑内重要的抑制性神经递质,GABA 能神经元的谷氨酰胺在谷氨酰胺酶作用下转变为谷氨酸,在谷氨酸脱羧酶作用下转变为GABA,并在囊泡转运体作用转运入囊泡,当GABA能神经元转去极化,GABA 释放至细胞外空间,星形胶质细胞上特异性表达3 型GABA 转运体[33](GABA transporters 3,GAT3),GAT3 活动依赖Na+浓度梯度,而经GAT3 转运入星形胶质细胞内的GABA 进入三羧酸循环进而转化为谷氨酸。谷氨酸为GABA 氨基酸合成的前体,当NKA 活性异常导致GABA 合成减少或转运异常,导致神经系统兴奋性活动相对亢进。

3.4 NKA 与能量代谢

葡萄糖为大脑能量主要来源[34]。 NKA 参与脑组织中葡萄糖代谢。在脑细胞内的葡萄糖在己糖激酶作用下转化为葡萄糖-6-磷酸,此后有三条代谢途径:糖酵解后生成丙酮酸进入线粒体三羧酸循环氧化供能或在乳酸脱氢酶作用下还原为乳酸；磷酸戊糖途径；生成糖原。神经元释放谷氨酸,星形胶质细胞清除谷氨酸,细胞内Na+浓度升高,激活NKA,ATP 消耗增加,激活星形胶质细胞上表达的葡萄糖转运体1(glucose transporters1,GLUT1)进而循环中摄取葡萄糖、糖酵解增加[35-36],乳酸生成增加；乳酸在单羧酸转运体( monocarboxylate transporters,MCTs)作用下进入神经元,单羧酸转运体的亚型MCT1、MCT4 主要在星形胶质细胞中表达,而MCT2 主要分布于神经元上,且MCTs 的功能受胞内Na+浓度调控[25]；随后乳酸进入在线粒体中经过三羧酸循环氧化,产生更多的ATP。在神经元胞质内表达有ATP 敏感性钾通道(ATP-sensitive K+channels, KATP),当ATP 水平升高时,KATP 通道关闭,组织K+进入胞内,从而促进膜去极化和神经元电活动[36]。而当NKA 功能异常时可能影响葡萄糖转运、乳酸穿梭、KATP 等,导致膜去极化或产生动作电位,进而影响癫痫发生或易感性。研究表明,耐药性癫痫患者和小鼠癫痫模型中均存在葡萄糖低代谢表现[37-38]。 Freitas 等[39]研究显示,在体内外,利用匹罗卡品小鼠癫痫模型证明NKA 活性降低可导致谷氨酸释放增加、葡萄糖低代谢,恢复NKA 活性可维持谷氨酸正常水平、恢复葡萄糖代谢。葡萄糖低代谢还与癫痫脑内神经元重塑、异常网络形成相关[38],能量代谢异常可影响递质传递和癫痫发作和扩散[40]。

此外,NKA 亲和性下降,可能导致能量供应不足或ATP 蓄积而影响KATP。 Smeland 等[41]发现在颞叶癫痫小鼠中,线粒体能量代谢障碍可加剧海马NKA 与ATP 亲和力下降。 Funck 等[9]发现α2/3 亚型ATP 酶对癫痫小鼠海马中ATP 的亲和力降低。

3.5 Calponin-3

Calponin-3 是由 CNN3 基因编码[42]。 Han等[43]发现耐药性癫痫患者及癫痫鼠海马组织中calponin-3 表达量均明显增加。 Calponin 与肌动蛋白结合可抑制ATP 酶活性[42-44], 而大脑中的NKA又是神经元兴奋性的主要调节因子,calponin-3 在神经元、星形胶质细胞中均有表达。因此,calponin-3有可能通过抑制NKA 活性来调控癫痫易感性,潜在机制需进一步研究。

4 癫痫相关的ATP 酶活性调控机制

NKA 活性调节有很多方式,如遗传突变、磷酸化/去磷酸化、硝基化、激动剂/抑制剂等。

4.1 遗传突变

大部分基因突变可导致NKA 功能改变或丧失。Myshkin 小鼠Atp1a3 的I810n 突变、Mashl 小鼠Atp1a3 的D801n 突变均可导致α3 亚型NKA 活性失活[45]。但有些基因突变可导致NKA 稳定性改变、表达水平下降或膜靶向缺陷。如NKA 与锚蛋白B、小窝蛋白1 相互作用基序突变可导致NKA 膜靶向改变[46]。

4.2 磷酸化/去磷酸化

磷酸化是指在蛋白激酶作用下,蛋白质氨基酸的羟基被磷酸基团取代；反之为去磷酸化。 NKA 活性受磷酸化/去磷酸化修饰,Marquezan 等[47]发现在戊四氮诱导小鼠癫痫发作NKAα 亚基Ser943 的磷酸化显著增加,其活性下降。而Mallick 等[48]研究表明,NKA 去磷酸化可导致酶活性增加。

4.3 硝基化

硝基化是指向有机物中引入硝基的过程。 NKA的硝基化可能调控其活性(此过程不可逆)。 Ryan等[49]研究显示在海仁酸诱导的SE 后6 周,大鼠海马神经元中的NKA 总酶硝基化逐渐增加。 Funck等[9]在匹罗卡品诱导的小鼠癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)后2 个月,NKA 的硝基化水平升高,导致NKA 活性下降。但SE 可能会出现大脑缺血缺氧状态,而在新生儿缺血缺氧性脑病中也观察到NKAα3 亚基硝化水平显著上升[50-51]。因此,硝基化对于酶影响是否可导致癫痫尚且存在争议。

4.4 激动剂与抑制剂

哇巴因特异性作用于NKAα 亚基上发挥抑制作用。在人类中,哇巴因与三种NKAα 亚型亲和力相近[52]。在啮齿类动物中,哇巴因与各亚型的亲和力差异较大:与α3 亚型亲和力最高,α2 次之,α3 亲和力最低[53-54]。哇巴因可抑制NKA 活性导致癫痫发生[55]；DRRsb 可激活NKAα3 亚型进而降低癫痫易感性[10]；有些药物为剂量依赖性,低剂量发挥激动作用,高剂量则转变为抑制作用:如艾地苯醌、南天竹非碱[56-57]；一些儿茶酚胺类对NKA 活性具有调节作用,如:芬普雷司能增加突触间隙的去甲肾上腺素和多巴胺,有趣的是芬普雷司能在脑纹状体增加NKA 活性,而在丘脑内却是使NKA 活性降低[58],其机制可能是通过作用于α1 A 肾上腺受体使NKA 去磷酸[48]。