疾病相关小胶质细胞在阿尔兹海默症发病中的作用研究

崔雨沙,路 欣,李 峰

(1.首都医科大学基础医学院2016 级五年制临床医学专业,北京 100069；2.首都医科大学基础医学实验教学中心形态学实验室,北京 100069；3.首都医科大学神经生物学系,北京脑重大疾病研究院,北京神经再生修复研究重点实验室,北京 100069)

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种年龄相关的的神经退行性疾病,组织学表现为Aβ斑块沉淀以及神经纤维缠结和神经炎症的形成[1]。AD 患者危险基因位点很大一部分位于小胶质细胞[2],如Trem2、Apoe 等；而小胶质细胞是大脑主要的免疫细胞,与神经退行性疾病的发生息息相关。以往对小胶质细胞的研究大多采用M1、M2 分型的方式对其功能进行解释[3]。 但随着现在技术的进步,如全基因组测序、表观遗传学分析等,我们对小胶质细胞和疾病的认识更加深入和全面,这一分型已经不能满足我们的需求。 利用单细胞测序等方法,从细胞转录组角度,最近发现了一种新的小胶质细胞亚型——疾病相关的小胶质细胞(disease associated microglia,DAM),它在AD 晚期担任着重要的保护作用,为AD 疾病的治疗带来了新的曙光。本文综述了近年来小胶质细胞在AD 发病中的研究进展,特别从小胶质细胞的分型进行归纳总结,以期对广大研究工作者更多启发。

1 小胶质细胞在正常状态和AD 疾病中的作用

小胶质细胞大约占人类大脑所有细胞的0.5%到16.6%,是大脑中最主要的免疫细胞,起源于胚胎七到八天的原始骨髓祖细胞,由卵黄囊分化而来,和循环系统的单核细胞相互独立[4]。 正常状态下,小胶质细胞可以在没有外周造血细胞输入的情况下进行自我更新并且保持固有数量[5]。 作为大脑中的免疫细胞,小胶质细胞主要通过表面的受体不断感受周边的病原体、凋亡神经元等刺激,从而做出相应反应,起到维持大脑内环境稳态的功能。它也有许多不同于吞噬细胞的功能,如修剪突触、促进神经元再生、组织轴突的投射等[3],对于大脑的发育至关重要。 AD 疾病状态时,小胶质细胞会被激活,激活的小胶质细胞主要有两方面的作用,一方面参与炎症反应,在Aβ 刺激下使NF-κB 等转录因子活化,从而引起一系列炎症因子的转录,产生炎症因子如IL-1β、TNFα[6]等,介导炎症反应；另一方面小胶质细胞可以介导Aβ 的吞噬,减少Aβ 沉积[7],还可以通过Trem2 形成小胶质细胞屏障[8],最终减少Aβ 对AD 病人的危害,延缓病情发展。 随着疾病的分期不同,小胶质细胞起的作用亦不相同。 AD 的疾病病程主要可以被分为三期,AD 初期为Aβ 斑块的形成期,这一期小胶质细胞可以通过炎症小体NLRP3 中的ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)来协助Aβ 蛋白聚集以及在大脑中播散,并且产生一些炎症因子来促进Aβ 斑块的形成,因此在这一期的炎症反应主要为有害的作用；AD 中期为Aβ 斑块沉积期,这一期Aβ 斑块增加,小胶质细胞通过Trem2 介导形成小胶质细胞屏障来抑制Aβ 斑块的扩散,防止其毒害周围的神经元,起着神经保护性的作用；AD 末期为TAU 蛋白沉积、Aβ 蛋白达到稳定的时期,这一期神经元的死亡增加,活化的小胶质细胞在清除死亡神经元的过程中诱导了炎症反应以及星形胶质细胞的活化,造成更多神经元的死亡,形成一个恶性循坏[9]。

2 传统的小胶质细胞分型——M1、M2 型小胶质细胞

为了解释小胶质细胞的复杂功能,传统观念把小胶质细胞分为M1、M2 两型,而这一分型最初是从外周吞噬细胞分型借用来的。 研究者们发现吞噬细胞在T 细胞分泌的两种炎症因子IFNγ 和IL-4的诱导下,会产生两种完全不同的细胞表型:M1 和M2 型,它们的表面标志物以及功能都不相同,反映了吞噬细胞在多种免疫环境下可以产生不同的表型来发挥作用。 但小胶质细胞作为大脑特有的免疫细胞,它的来源、生存环境、结构特点以及所发挥的作用都和吞噬细胞不一致,因此,简单地把吞噬细胞分型引入到小胶质细胞是不科学的。 为了验证这一观点,我们使用单细胞RNA 测序的方法去分析脑部创伤模型小鼠大脑中的小胶质细胞,结果确实无法找到只表达M1 型或M2 型标志基因的小胶质细胞[3]。 所以,M1、M2 型小胶质细胞并没有转录谱以及其他科学依据的支持,这一分型的合理性值得怀疑。 为了克服其局限性,我们需要寻找一个新的、合理的小胶质细胞分型,来指导我们接下来的道路。

3 一种新的小胶质细胞类型——疾病相关小胶质细胞

脱离原有利用细胞标志物来对小胶质细胞进行分型的思路,最近的单细胞RNA 测序技术帮助我们客观地认识免疫细胞的类型及其状态,提供了一个从转录组方面定义细胞类型的新工具。 利用此方法,2017 年Keren-Shaul 等[10]发表的文献介绍了在阿尔兹海默症5XFAD 转基因小鼠模型中发现的一种AD 小鼠特有的小胶质细胞——疾病相关小胶质细胞(DAM),它在这一疾病模型的病理晚期特异性的出现而不在野生型小鼠中出现,主要标志物为CD9、CD11、Clec7a 和CD63,定位于Aβ 斑块附近。Keren-Shaul 等[10]的研究发现,与稳态小胶质细胞相比,DAM 有着截然不同的基因型,出现一些基因的下调如Cx3cr1；也有一些基因的上调如Apoe、Lpl、CD9、Cst7、Trem2,是一种新的小胶质细胞类型。DAM 高表达脂代谢和吞噬相关基因,可以吞噬Aβ蛋白,帮助大脑清除Aβ 沉积,起保护性作用。 但在AD 后期,由于Aβ 活化了炎症小体,而炎症小体的ASC 可以协助Aβ 斑块的沉积[10],DAM 反而会加速病情发展。 除5XFAD 小鼠,在其他神经退行性病变小鼠模型如ALS、APP 小鼠也有DAM 的存在[11],但这些DAM 是否为同一种小胶质细胞,还需要进一步的探究。

DAM 主要由凋亡的神经元和髓鞘碎片等诱导产生,磷脂酰丝氨酸为DAM 识别凋亡细胞的靶点[12]。 这些可以诱导DAM 产生的物质,有学者把它 们 称 为 神 经 变 性 相 关 分 子 模 式( neurodegeneration-associated molecular patterns,NAMP),类似于外周诱导吞噬细胞活化的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),包括死亡神经细胞凋亡体、髓鞘碎片、脂类降解产物、神经退行性疾病和衰老所形成的细胞外蛋白聚集(如Aβ)等。 识别NAMP 需要DAM 上相应的受体,如Trem2、TAM(Tyro3/Axl/Mer)、嘌呤受体P2Y12,它们分别介导不同的功能[13]。 对于这些受体的深入研究,可以帮助我们更好的理解DAM在AD 及其他神经退行性病变中的作用。

3.1 DAM 的分型

小胶质细胞在神经退行性疾病中的作用是多方面的,疾病晚期的小胶质细胞亦然。 Rangaraju等[14]2018 年发表的文献以CD11b 为主要标志物筛选疾病晚期的小胶质细胞,然后通过整合小胶质细胞转录组数据集和验证研究,发现了促炎和抗炎两类小胶质细胞。 其中抗炎的小胶质细胞以CD44、CD45 和CD274 为标志,主要富集参与碳水化合物和脂质代谢、胆固醇外排、抗原呈递、氧化还原酶活性和衰老/自噬的胞浆蛋白相关基因,可以被NFkB、Stat1、P53 和RelA 调控；促炎的小胶质细胞以CXCR4 为标志,主要富集促炎功能相关基因,包括免疫信号、细胞增殖、粘附、抗原呈递、钙内流和细胞因子的产生等,可以被LXRα/β 和Atf-1 调控。这两类小胶质细胞高表达DAM 的特征基因,在阿尔兹海默症5XFAD 转基因小鼠分离的DAM 中,也可以根据细胞标志找到这两类小胶质细胞,因此,这两类小胶质细胞为DAM 的两个亚型,分别命名为促炎DAM 和抗炎DAM。 这两个DAM 亚型均在Trem2 的下游出现,抑制Trem2 后便不会产生这两种小胶质细胞亚型[14]。

但是DAM 为病理晚期出现的小胶质细胞类型,无法解释小胶质细胞的转录组随着时间是如何变化的。 为了探查不同疾病时期小胶质细胞的转录组,Mathys 等[15]的研究对AD 小鼠模型不同病理阶段的小胶质细胞分别进行了单细胞RNA 测序及分析。 文献结果表明在病理早期的小胶质细胞高表达DNA 复制和修复以及细胞周期相关的基因,其上调的基因主要与细胞增殖分裂相关,小胶质细胞在神经退行性病变中的增殖反应主要在这一阶段完成；而病理晚期的小胶质细胞上调的基因主要为免疫反应相关的基因。 病理晚期的小胶质细胞按照转录组的不同又可以分为两类,一类为1 型干扰素诱导的基因模块,调控抗病毒和干扰素应答反应,主要与神经元的DNA 损伤有关,神经元DNA 的损伤可以诱导出此类小胶质细胞；一类为2 型干扰素诱导的MHC II 类基因模块,主要以T 细胞非依赖的方式发挥作用,可以放大神经退行性病变的症状[15]。 比较这一分型中病理早期小胶质细胞与DAM 基因的异同,发现病理早期小胶质细胞的基因与DAM 相似性不高。 而病理晚期小胶质细胞基因变化与DAM 大致相同:在DAM 上调的278 个基因中,202 个都在病理晚期的小胶质细胞中上调。 但是许多抗病毒和干扰素反应相关的基因在病理晚期的小胶质细胞中上调而不在DAM 中上调[15]。 关于病理晚期的小胶质细胞在疾病中是起一个保护性还是伤害性或中立性的作用,目前还不清楚,需要进一步的探究。

3.2 DAM 相关的关键位点

3.2.1 Trem2 和DAM

Trem2 是AD 的一个主要风险基因,基于单细胞测序的研究发现,Trem2 可以决定DAM 表型的出现。稳态的小胶质细胞通过两步变为DAM:第一步为不依赖于Trem2 的过程,在这一步稳态小胶质细胞的关卡基因如Cx3cr1 和P2ry12/P2ry13 下调,而一些AD相关的基因如B2m、Apoe 上调,小胶质细胞转变为中间态DAM；第二步为依赖Trem2 的过程,小胶质细胞Trem2 高表达,吞噬和脂代谢相关的基因如Cst7 和Lpl 高表达,转变为最终的DAM[16]。 关于Trem2 介导DAM 转型的具体机制,有研究发现Trem2 可以通过激活mTOR 通路来调节小胶质细胞的代谢,促进小胶质细胞的生长增殖。 如果敲除Trem2,mTOR 会被抑制,而长期的mTOR 缺陷会导致整体小胶质细胞功能障碍、细胞存活率和增殖率降低。 因此Trem2 可能是通过维持第一步活化的小胶质细胞的活化状态以及生存状态来实现第二步的转变的[17],而不是通过介导一种新的基因型的变化。

3.2.2 APOE 和DAM

APOE 是一种能够结合和运输胆固醇以及脂质的蛋白,在人类有APOE2、APOE3、APOE4 三种亚型。 其中APOE4 的纯合子可以使AD 的发病率提高12 倍；APOE2 则可以延迟遗传性AD 的发病年龄；APOE3 与AD 发病无明显相关性。 APOE 在稳态的小胶质细胞中表达量很低,但在DAM 中APOE表达却大幅增加,是DAM 中表达量上调幅度最大的基因之一。 用凋亡的神经元去激活小胶质细胞,可以通过Trem2 诱导出APOE 的活化,进而调控APP-PS1 和SOD1 小鼠中小胶质细胞的类型转换,使小胶质细胞向DAM 的方向转变,形成促进DAM转型的Trem2-APOE 轴；若把APOE 或Trem2 敲除,小胶质细胞便不会向DAM 方向转变[18]。 从亚型的层面研究APOE,发现APOE4 的表达可以使小胶质细胞对于受伤的神经元有更高的攻击性,促进静息态小胶质细胞转变为DAM,所以在TREM2-APOE轴起主要作用的APOE 亚型可能为APOE4[19]。

3.2.3 IRF1、LXRβ 和CEBPα

在促炎和抗炎DAM 发现之后,有研究对小胶质细胞的转录组数据进行网络分析,确定了几个可以调节小胶质细胞类型转变的转录因子,分别为CEBPα、IRF1 和LXRβ。 CEBPα、IRF1 和LXRβ 都可以调节DAM 的核心基因如Apoe、Axl、Clec7a、Tyrobp 和Trem2,很大程度上决定了稳态小胶质细胞向DAM 的转型。 其中IRF1 调节稳态小胶质细胞、促炎DAM、抗炎DAM 三个模块的基因,在小胶质细胞反应中起双重作用；CEBPα 和LXRβ 则主要调节稳态小胶质细胞和抗炎DAM 的基因,起保护作用。 除了调节促炎和抗炎DAM 表型,CEBPα、IRF1 和LXRβ 还可以下调小胶质细胞介导的神经元突触修剪相关的基因,而IRF1 和LXRβ 可以上调吞噬相关的基因,增强小胶质细胞对Aβ 的吞噬,因此IRF1 和LXRβ 可能通过介导从稳态小胶质细胞的突触修剪功能向AD 的吞噬清除功能的转变,来促进促炎DAM 表型的生成[20]。

3.2.4 其他DAM 危险基因

除上述位点外,还陆续发现了许多其他与DAM相关的危险位点。 (1)CD33 和TYROBP/DAP12 分别为Trem2 上游和下游的分子,且在DAM 中表达量大幅增加[14]。 (2)膜受体ABCA7、Tyro3/Axl/Mer(TAM)、CX3CR1 与P2Y12 等分别可以结合Aβ 蛋白、凋亡神经元、补体与细胞外ADP 等,对于DAM的功能至关重要。 (3)细胞激酶RIPK1 可以介导一部分小胶质细胞的基因变化,促使小胶质细胞向DAM 的转型[21]。 (4)基因分析发现了一些调节DAM 表型的基因,其中Apoe, Hla-dqa1 可以促进促炎DAM 的表达；Ms4a4e, Hla-dqb1 和Treml2 促进抗炎DAM 表达；Bin1, Cnn2,Picalm 和Sorl1 促进稳态小胶质细胞基因表达[14]。 (5)许多基因的变异可以增加疾病发生的风险如TYROBP、GRN 等,另一些基因如MS4A6A、PLCG2、PICALM 等的变异则可以对疾病起保护性作用,而这些基因都与DAM有很强的相关性,在DAM 中的表达量与稳态小胶质细胞相比差异显著[13]。

4 研究展望

显然,从转录组学方面对小胶质细胞进行全面分析,构建小胶质细胞分型可以摆脱传统细胞分型的局限,更加全面和科学的认识小胶质细胞在疾病中的作用。 但这一分型体系研究仍在初始阶段,对于小胶质细胞在不同时期是如何被诱导为特异的亚型、不同亚型的小胶质细胞所承担的具体作用,以及这些分型中所预测到的AD 危险位点所介导的作用都尚未清楚,因此,关于DAM 的相关研究仍需深入,以期对AD 开辟新的诊治思路。