QuEChERS-HPLC-MS/MS法检测谷物源性食品中3种赭曲霉毒素

林琳

江苏康正生物科技有限公司（高邮 225600）

赭曲霉毒素是由赭色曲霉属真菌产生的一种类真菌毒素，对人体具有肝毒性、肾毒性，有致癌、致畸、致突变的危害[1-3]。常见的赭曲霉毒素有赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB）和赭曲霉毒素C（Ochratoxin C，OTC），其中以OTA毒性最大，化学结构如图1所示[4-6]。在自然条件下，污染的谷物粮食中一般都是几种真菌毒素混合存在的状态，而目前标准中主要是针对赭曲霉毒素A的检测方法居多[7-9]。为了避免低估赭曲霉毒素的总摄入量和可能的不良反应，必须考虑这3种毒素在人体内累积所达到的毒性效果。所以建立一种针对谷源性食品中同时检测3种赭曲霉毒素的检测方法很有必要，对评价此类食品的安全具有重要意义。

目前对谷物源性食品中赭曲霉毒素的研究主要集中在OTA的分析检测，有薄层色谱法、酶联吸附免疫法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法[10-15]。薄层色谱法对检测仪器及人员要求较低，但是此方法精度较差、试验步骤冗长繁多[16-17]；酶联免疫吸附法具有灵敏、快速等优点，但是存在交叉污染反应的缺点[18-19]；高效液相色谱法应用较为广泛，检测稳定性较好，但样品中基质易对赭曲霉毒素A产生干扰，前处理过程繁琐，且采用的免疫亲和柱成本较昂贵[20-22]。鉴于上述方法存在的不足，试验运用QuEChERS技术的净化特性，简化提取过程，尝试建立了QuEChERS净化技术结合HPLC-MS/MS法检测谷源性食品中3种赭曲霉毒素（OTA、OTB 和OTC）的方法，方法灵敏度高、重现性好，降低了检测成本，可为谷物源性食品中赭曲霉毒素的分析和监控提供技术支持。

图1 OTA的化学结构

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；API 3500 QTrap超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（美国AB公司）。

OTA溶液标准物质（100 μ g/mL，lot：228012）、OTB溶液标准物质（100 μ g/mL，lot：228034）、OTC溶液标准物质（100 μg/mL，lot：228038）购于中国计量科学研究院。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸、乙酸（色谱纯，上海安谱公司产品）。

1.2 样品来源

样品均为随机购买于市场上销售的谷物源性食品。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Zorba-C18柱（2.1 mm×150 mm，3 μ m）。流速：0.3 mL/min。进样量：20 μL。柱温：30 ℃。流动相：A为0.10%甲酸溶液，B为乙腈。洗脱条件见表1。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脱条件

1.3.2 样品的提取与净化

称取1.0 g混合盐析剂置于10 mL离心管中，加入2.0 g样品，加入4.0 mL提取溶液。取1 mL上清液于2.0 mL PE管中，加入净化剂后涡旋10 s，离心取上清液，过膜后上机进样分析。试验分别比较不同的盐析剂、提取溶液以及净化剂组合对3种赭曲霉毒素检测的影响。

1.3.3 标准曲线的建立

吸取10 μL的3种赭曲霉毒素的标准溶液，用甲醇定容到10.0 mL配制成100.0 ng/mL的中间液，再配制成1.0，2.0，5.0，10.0和50.0 ng/mL一系列标准溶液，经仪器进行分析，绘制标准曲线。

1.3.4 方法的精密度、重复性与回收率

以未检出3种赭曲霉毒素的谷物源性运动食品为空白基质，加入不同浓度的OTA、OTB、OTC混合标液，使用QuEChERS提取后，上机检测计算回收率。

2 结果与分析

2.1 QuEChERS前处理方法的优化

2.1.1 盐析剂的选择

QuEChERS前处理试剂中的盐析剂多采用氯化钠、醋酸钠、无水硫酸镁、柠檬酸钠、柠檬酸钠二水合物和柠檬酸氢二钠盐倍半水合物等。Fernandes等[23]对大米中OTA检测时，对QuEChERS作了较成熟的筛选试验，采用了无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠二水合物和柠檬酸氢二钠盐倍半水合物，质量比为4︰1︰1︰0.5，提取效果良好，故试验选择了该比例混合试剂作为提取剂。

2.1.2 提取溶液的选择

参考文献[24-26]，赭曲霉毒素A的提取溶液一般采用的有甲醇-水、乙腈-水2种。试验分别配制4种提取溶液：提取溶液Ⅰ，甲醇-水（80︰20，V/V）；提取溶液Ⅱ，甲醇-水（60︰40，V/V）；提取溶液Ⅲ，乙腈-水（80︰20，V/V）；提取溶液Ⅳ，乙腈-水（60︰40，V/V）。分别提取加标样品中的赭曲霉毒素，试验结果以样品中3种赭曲霉毒素的加标回收率来比较提取溶液效果。

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如图2所示，提取溶液Ⅲ的提取效果最优，样品加标回收率最高，这可能与赭曲霉毒素的极性化合物性质有关，在此比例的提取溶液条件下，目标物在提取液中的分配系数高。且试验中提取溶液Ⅲ与试样比为2∶1（mL/g）时，加入盐析剂样品高速均质后不易产生乳浊液，上层提取液易过滤分层，比较适合进行下步的试验方案。

图2 4种提取溶液对赭曲霉毒素回收率的影响

2.1.3 净化剂的优化

QuEChERS前处理技术常用的净化剂有PSA、GCB、C18、NH2、中性氧化铝、弗罗里硅土、SiO2。试验考察了不同净化剂以及不同添加量对回收率的影响。结果显示，C18、NH2、弗罗里硅土和SiO2为较优净化剂，结果见图3。

试验还比较了SiO2+C18、NH2+C18和弗罗里硅土+C18共3种QuEChERS净化剂组合，以提高目标物的响应值。

如图4所示，30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4和30 mg弗罗里硅土+30 mg C18+150 mg MgSO4两组对OTA、OTB、OTC响应值较高，前者的平均回收率更高，所以试验选择了30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4组合作为净化剂。

图3 3种赭曲霉毒素经不同净化剂处理后的回收率比较

图4 3种赭曲霉毒素经不同净化剂组合处理后的回收率

2.2 流动相的选择

赭曲霉毒素属于极性化合物，因此流动相以水和乙腈作为基础溶剂。为了促进样品的离子化，试验比较了流动相中加入0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸铵对3种赭曲霉毒素分离效果的影响。结果表明，加入甲酸时的离子丰度最强，因此最终确定在流动相中添加0.1%甲酸进行梯度洗脱。标准溶液色谱图见图5。

图5 赭曲霉毒素标准物质色谱图

2.3 质谱条件的选择

用质量浓度为50 ng/mL的混合标准溶液，对目标物进行一级和二级质谱扫描，并优化质谱参数。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数。3种化合物的质谱分析参数见表2。

2.4 方法的线性范围与灵敏度

在乙腈-0.1%甲酸流动相体系中，以表1梯度洗脱的步骤，按1.3.3试验步骤配制3种赭曲霉毒素的标准溶液，绘制标准曲线。结果表明：3种赭曲霉毒素在1.0～50.0 ng/mL质量浓度范围内均具有良好的线性关系，结果见表3。

表2 3种赭曲霉毒素的多反应监测扫描模式的质谱参数

表3 3种赭曲霉毒素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.5 方法的精密度、重复性与回收率

表4 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）

在加标回收试验中，选用面粉基质、米粉基质、燕麦基质、玉米基质4种空白基质的样品，分别添加1倍限量、2倍限量和10倍限量低、中、高的三个水平混合标准品，每个结果测定5次，进行加标回收的试验。

由表4可见，在4种不同的谷源性基质样品中，3种赭曲霉毒素（OTA、OTB、OTC）的回收率为84.6%～107%，精密度为2.15%～5.67%，说明试验的检测数据的准确度和精密度可行。

3 结论

试验建立了一种QuEChERS-HPLC-MS/MS检测谷物源性食品中3种赭曲霉毒素的分析方法。结果表明，样品经乙腈-水（80︰20，V/V）进行提取后，经30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4组合净化剂处理后，可有效去除谷物源性食品中的干扰物对目标峰的影响，实现对3种赭曲霉毒素的净化，在质谱检测器的多反应监测模式下，可实现同时对谷物源性食品中OTA、OTB和OTC三种赭曲霉毒素的定性和定量分析。在4种谷源性样品基质中，加标回收率为84.6%～107%，相对标准偏差（RSD）在2.15%～5.67%之间，所建立的方法具有可靠的准确度和精密度，能准确快速有效地检测谷物源性食品中的3种赭曲霉毒素的含量，可为谷物源性食品中OTA、OTB和OTC的分析和监控提供技术支持。