基于GC-MS结合多元统计方法分析不同种类柑橘汁中香气物质

成传香，王鹏旭，贾蒙，周心智，马亚琴*

1(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712) 2(重庆市农业科学院，果树研究所，重庆，401329)

柑橘是世界第一大宗水果，其品种主要包括宽皮柑橘、橙类、柚类、柠檬和金柑等[1]。其中橙类在2018、2019年度全球产量预计达5 180万t，中国为720万t；宽皮柑橘全球产量预计达3 140万t，中国为2 200万t，占全球宽皮柑橘产量的70%以上[2]。中国柑橘种植以宽皮柑橘为主，主栽的三大柑橘品种为温州蜜柑、椪柑和南丰蜜桔；橙类分为甜橙、血橙和脐橙等，其中甜橙是榨汁的主要品种。柑橘由于其风味独特及富含营养物质而深受消费者的喜爱，其中风味由香气物质的种类、含量及比例决定，是影响柑橘果实品质最重要的特性之一。而香气物质是果实成熟过程中的次级代谢产物，主要为烯烃类、醇类、醛类、酮类和酯类等[3]。

感官评定是评价柑橘汁香气品质的常用方法之一，但其受评定者主观因素影响较大，因此需结合气质联用法以确定香气物质的种类和含量。利用香气值(odor activity value，OAV)，即香气物质的浓度与香气阈值的比值来判断香气强度，从而可确定香气物质对整体风味的贡献程度，其中OAV>1的香气物质被称为香气活性物质。在对香气物质分析鉴定时，传统的方差分析(analysis of variance, ANOVA)无法准确有效地鉴别重要香气物质，而多元统计分析学则可以弥补这一不足，目前在食品风味分析中已得到广泛应用，主要包括主成分分析(principle component analysis，PCA)和偏最小二乘回归分析(partial least square regression，PLSR)等。其中PCA是将原来众多且具有一定相关性的指标进行重新组合，从而得到一组新的互相无关的综合指标来替代原来的指标。PCA的优势在于其对多项指标降维的同时能保留数据中的主要信息，从而减少了运算的复杂度和时间，现已广泛应用于水果[4]、白酒[5]以及精油[6]的风味研究中。而偏最小二乘法是一种多因变量对多自变量的回归建模方法，是一种比较完善的基于因子分析的多变量校正方法。它在考虑自变量的同时也考虑了因变量的作用，同时通过折中各自空间内的因子，使模型能较好地同时描述自变量和因变量，牛云蔚等[7]利用PLSR研究了樱桃酒呈味物质与感官质量的相关性，确定了对每个感官属性有显著性贡献的呈味物质。林顺顺等[8]则利用PLSR研究了烟叶中化学成分与感官质量的相关性。

本研究拟采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法(HS-SPME/GC-MS)检测各类柑橘汁中香气物质的含量，通过OAV值筛选出香气活性物质，并比较品种和压榨方式对香气物质种类及含量的差异，同时利用多元统计分析学分析柑橘种类、感官属性和香气活性物质之间的相关性，以确定香气物质对风味的贡献程度，为柑橘果实加工及种类辨别提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验共选用12种柑橘原料制汁(见表1)，其中南丰蜜桔分为2批榨汁，一批机器压榨制汁(西南大学柑桔研究所中试车间FMC压榨机压榨)，另一批手榨制汁(家用锥式榨汁机压榨)；哈姆林样品汁从重庆忠县派森百公司生产线上精滤加工单元取样，其他果汁样品均采取锥式压榨。榨汁后经80目无菌纱布过滤，存于-80 ℃超低温冰箱备用。

环己酮(分析纯，纯度≥99.5%，质量浓度为0.95 mg/μL)、C5～C25正构烷烃标准品，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；大茴香醛、叶醇、2-苯乙醇、癸醛和三乙酸甘油酯均为标准品，上海阿拉丁试剂有限公司。

表1 柑橘果实种类、分类及来源地Table 1 The species, classification and origin ofcitrus fruits

1.2 仪器与设备

7890A/5975C气相色谱-单四极杆质谱仪(配DB-5MS石英毛细管柱),美国Agilent公司；Combi PAL气相色谱多功能自动进样器,瑞士CTC公司；Milli-Q Advantage A10超纯水系统,美国Millpore公司；PB3002-S/FACT分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS 50/30 μm)萃取头,美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 香气物质测定

1.3.1.1 样品萃取条件

参照郑洁等[9]的方法，并加以修改。准确称取5.0 g果汁，置于20 mL螺口玻璃瓶中，加入1.0 g干燥后的NaCl，再加入2 μL环己酮作为内标物，用聚四氟乙烯隔热垫密封瓶盖旋紧备用，每个样品测定3次。顶空固相微萃取条件：40 ℃平衡20 min；顶空吸附30 min；解析5 min。

1.3.1.2 色谱和质谱条件

气相色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至 240 ℃，保持2 min；进样口温度250 ℃；不分流进样；载气为He (纯度>99.999%)；载气流速1 mL/min。

质谱条件:电子电离(electron ionization，EI)源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度 230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z35～400。

1.3.1.3 定性和半定量分析

利用图谱库(NIST 2008和Flavour 2.0)的检索结果，并以C5-C25正构烷烃的保留时间计算出化合物的相对保留指数，结合相关文献[10-11]定性，确定相应的挥发性物质。定量方法采用内标法，内标物为环己酮。通过各成分峰面积与内标物峰面积对比进行半定量分析，含量单位为μg/g。

1.3.2 感官评价

根据ISO8589:2007标准在感官实验室中进行感观分析。参与感官的小组人员共计12人，其中6男6女，成员年纪在20～30岁之间。参考相关文献[11]，确定本次研究的柑橘汁香气描述词依次为：甜香、果香、青香、花香、皮感和木香，之后对小组人员进行香气训练。各感官属性的定义及香气训练标准见表2。

表2 各感官属性的定义及香气训练标准Table 2 Definition of sensory attributes and training criteria for aroma

感官实验采用10点打分制(0～9)，即：0代表没有嗅闻到该香气，9代表该香气强度极强；从0到9香气强度呈递增趋势。本次感官评价实验是在无异味的感官实验室中进行，将准备好的果汁样品盛放在无异味的品评杯中，经随机编码后交给感官评价员对每种样品的感官属性进行打分，进行2次重复。

1.4 数据分析

采用SPSS Statistics 17.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，XLSTAT 2016软件进行主成分分析，Unscrambler软件进行偏最小二乘法分析，EXCEL 2013用于绘制图表及数据整理。

2 结果与讨论

2.1 不同种类柑橘汁香气物质的种类和含量

实验中采用HS-SPME/GC-MS测定13种柑橘汁中的香气物质的种类和含量，共测得67种挥发性物质，其中烯烃类物质种类最多(15种)，其次为醇类(14种)、酯类(13种)和醛类(12种)物质种类，酚类物质种类最少，仅有2种。此外，另有4种酮类物质和7种其他成分被检测出来。

从表3中可以看出，在所有柑橘汁的香气成分中，烯烃类物质在种类和含量2方面都占比极大，其中含量所占百分比最高可达95%。3种宽皮柑橘的香气物质种类和含量要低于爱媛38号杂柑和大部分橙类(塔罗科血橙和奥林达夏橙除外)，其中椪柑和南丰蜜桔分别是香气物质含量最高和最低的宽皮柑橘，但南丰蜜桔的香气物质种类要高于其他2种宽皮柑橘。南丰蜜桔分为两批榨取，分别为机榨和手榨，机榨汁中的香气物质种类和含量要远高于手榨汁，原因是机榨过程中，柑橘果皮精油中的香气物质进入到汁中。爱媛38号杂柑香气物质含量虽高于宽皮柑橘，但明显低于绝大部分橙类。在所有橙类中，红夏橙和纳塔尔晚熟甜橙的香气物质含量最高，塔罗科血橙和奥林达夏橙含量最低，并且所有甜橙类香气物质含量均高于塔罗科血橙。同为榨汁的主要品种，美国的新奇士橙和中国的江津长叶橙香气物质含量相差无几。哈姆林作为国内甜橙榨汁主要品种之一，其机榨样品汁中香气物质种类最多，但含量并不高，原因可能是派森百公司车间榨汁采用的是切半式榨汁，因此没有全果压榨汁中其香气物质含量高。

表3 不同种类柑橘汁中各类香气物质含量及数量Table 3 The content and amount of various aroma substances in different citrus juices

注：括号里的数字表示香气物质的数量。

醇类香气物质主要是芳樟醇、α-松油醇和4-萜烯醇，橙花叔醇和苯乙醇分别只存在于南丰蜜桔手榨汁和机榨汁中，正庚醇是江安夏橙特有的醇类香气物质。醛类香气物质主要是反式-2-己烯醛、壬醛和癸醛，正己醛和α-甲基肉桂醛都是爱媛38号特有的醛类香气物质。香芹酮、香叶基丙酮和β-紫罗兰酮作为主要的酮类香气物质在宽皮柑橘、杂柑和橙类分布中没有显著差异，而诺卡酮只存在于橙类果实中。酯类物质作为一类重要的香气物质，存在于甜橙中的种类和数量要明显高于宽皮柑橘和杂柑。烯烃类香气物质主要有柠檬烯、月桂烯和巴伦西亚橘烯等，与江倩[12]的研究结果一致。其中柠檬烯在所有香气物质中含量是最高的，对伞花烃只存于南丰蜜桔手榨汁和塔罗科血橙汁中。

2.2 不同种类柑橘汁中特征香气物质

含量高的香气物质其香气强度不一定高，如含量高的柠檬烯对整体香气贡献程度并不高，利用OAV值可以较准确地判定香气强度。OAV>1的香气物质称为特征香气物质，也叫做香气活性物质，OAV值越高，香气强度越大，对整体香气的贡献程度也就越大。查阅相关文献[13-15]得到香气物质的香气阈值，结合GC-MS的定量结果，计算所得OAV值。表4所示为13种柑橘汁中OAV>1的香气物质。

表4 不同种类柑橘汁中OAV>1的香气物质Table 4 Aroma substances of OAV>1 in different citrus juices

由表4可以看出，13种柑橘汁中OAV>1的香气物质总共37种，醇类、醛类、酮类、酯类、萜烯类和酚类分别有8、6、4、6、11和2种，其中OAV值较高的香气物质有芳樟醇、壬醛、癸醛、β-紫罗兰酮、丁酸乙酯、巴豆酸乙酯、月桂烯和柠檬烯，与陈婷婷[16]的报道结果基本一致。柠檬烯虽然OAV值较高，但XIAO[11]利用GC-O发现，柠檬烯的强度得分为中等靠下，表明香气强度并不高。机榨哈姆林橙汁包含最多的特征香气物质，为30种，其次为江津长叶橙，包含29种，3种宽皮柑橘低于其他种类柑橘汁，分别包含19、21和17种。TAKAYUKI[17]在5种杂交宽皮柑橘品种中共检测到49种香气活性物质，其中醛类物质种类最多。SERKAN等[18]在2种血橙中共检测到了15种香气活性物质，OAV值较高的香气物质有芳樟醇、柠檬烯和诺卡酮。SHI等[19]认为丁酸乙酯、辛醛和癸醛等是甜橙的典型香气物质，芳樟醇、柠檬烯、辛醛和α-蒎烯是宽皮柑橘的典型香气物质。

2.3 感官评定

表5列出了13种柑橘汁中各感官属性的打分结果，其中同列感官属性评分上的不同字母表示不同种类的柑橘汁的感官属性有明显的差异性。方差分析结果表明，6种感官属性中皮感和青香的差异性最显著，其次是甜香、花香和果香，最后是木香。由感官评价结果可以看出，甜香和果香的评分较高，表明其特征香气比较突出。椪柑的甜香评分最高，手榨的南丰蜜桔样品汁果香评分最高，而青香评分最高的是纳塔尔晚熟甜橙，甚至要高于2种机榨的柑橘汁，除此之外，花香评分最高的是江津长叶橙，木香评分最高的是机榨哈姆林甜橙样品汁。由于机器压榨的原因，南丰蜜桔和哈姆林的皮感评分最高。对13种柑橘汁感官评价结果绘制雷达图,得到各汁样品的感官属性评分结果与雷达图一致，表明这6种感官属性可以较好的解释柑橘汁的香气特征。

表5 不同种类柑橘汁感官评价结果Table 5 Sensory evaluation results of different citrus juices

注：“a、b、c、d、e、f、g”代表不同种类柑橘汁中同一种感官属性的差异性。

2.4 不同种类柑橘汁、感官和香气物质的相关性分析

本研究以柑橘汁样品及感官属性作为分析对象，采用主成分分析法对13个柑橘汁样品的6种感官属性进行分析。第F1主成分的贡献率为66.06%，第F2主成分的贡献率为18.48%，2个主成分的累计贡献率已经达到84.54%，表明第F1、第F2两个主成分解释了原香气特征变量84.54%的方差信息。与第F1主成分呈现正相关的指标主要有甜香、果香和花香，与第F2主成分呈现负相关的指标仅有木香，其余均呈现正相关。

图1 主成分载荷图Fig.1 Principal component load diagram

由图1可知，13种柑橘汁样品根据距离远近被分在不同的象限内，第1主成分正半轴的NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、N0.7、N0.8、NO.9和NO.10为一类，负半轴的NO.5、NO.6、N0.11、NO.12和NO.13为一类。第2主成分正半轴的NO.7、NO.9、NO.10、NO.12和NO.13为一类，负半轴的NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6和NO.8为一类。

在PC1轴正方向有3种宽皮柑橘、1种杂柑、1种血橙和3种甜橙以及花香、果香和甜香，负方向有2种机榨汁样品、3种甜橙以及皮感、青香和木香。沿PC2轴，负方向仅有3种宽皮柑橘、2种机榨汁样品和1种血橙以及木香，其他种类柑橘汁及感官属性均对PC2的正方向工作效率较大。爱媛38号、椪柑和手榨南丰蜜桔汁样品与甜香在PCA图上距离较近，表明样品感官属性甜香较为突出。新奇士橙、江津长叶橙和奥林达夏橙与果香相关性较大，2种机榨汁样品与木香相关性明显，纳塔尔晚熟甜橙与青香和皮感相关性明显。13种柑橘汁样品与花香距离均较远，表明其与花香相关性较差。PC2轴可以明显将宽皮柑橘、杂柑、血橙与甜橙区分开来，PC1轴可以将机榨汁样品与手榨汁样品区分开来。除此之外，甜香不明显的温州蜜柑样品可以与另外2种宽皮柑橘区分开来，果香明显的新奇士橙、江津长叶橙和奥林达夏橙以及青香和皮感明显的纳塔尔晚熟甜橙可以与其他甜橙样品区分开。新奇士橙和江津长叶橙在PCA图中位置相近，表明各感官属性较为一致。YUAN等[20]通过PCA可以将宽皮柑橘、酸橙及血橙等13个柑橘品种区分开。LIVNAT等[21]利用PCA分析了柑橘杂交品种其香气物质的相似性。

以不同种类柑橘汁中的特征香气物质与感官属性作为分析对象，采用偏最小二乘法对37种特征香气物质和6种感官属性进行相关性分析。将特征香气物质含量作为X变量，每种柑橘汁样品的感官属性作为Y变量，建立PLSR模型，考察对每个感官属性显著性相关的特征香气物质，如图2所示。

图2 37种特征香气物质与6种感官属性之间的相关性分析Fig.2 Analysis of correlation between 37 characteristic aroma substances and 6 sensory properties

从图2中可以看出，甜香、青香以及花香与香气物质均有显著相关关系，没有香气物质与果香、皮感及木香显著相关。其中，辛酸乙酯和巴豆酸乙酯对甜香的正相关性最为显著，正辛醇、反式-2-己烯醛和丁酸乙酯对青香的正相关性最为显著，而与花香正相关性最显著的特征香气物质为香茅醇、叶醇、巴伦西亚橘烯和金合欢烯。而在陈佳莹[22]的研究中，芳樟醇和橙花醇对花香有积极效应。

3 结论

3种宽皮柑橘汁其香气物质的种类和含量均要低于杂柑和大部分橙类，南丰蜜桔机榨样品汁中香气物质含量要远高于手榨样品汁。在所有柑橘汁样品的香气物质中，共鉴定出37种特征香气物质，主要包括芳樟醇、月桂烯、壬醛等，其中包含特征香气物质最多的是哈姆林橙和江津长叶橙，最少的则为3种宽皮柑橘。

实验采用主成分分析和偏最小二乘法回归分析研究柑橘汁、感官属性和特征香气物质的相关性，结果表明：多元统计分析可以明确将3种宽皮柑橘、8种橙类和1种杂柑区分开，同时可以将宽皮柑橘品种以及橙类品种具体划分，还可以将机榨汁与手榨汁样品区分。宽皮柑橘的甜香属性较为突出，而与甜香具有积极效应的特征香气物质为辛酸乙酯和巴豆酸乙酯；新奇士橙、江津长叶橙和奥林达夏橙与果香相关性较大，2种机榨汁样品与木香相关性明显，但没有发现与果香及木香显著相关的香气物质；纳塔尔晚熟甜橙与青香和皮感相关性明显，而与青香呈正相关的物质有丁酸乙酯、正辛醇等。综上，本研究主要利用GC-MS和多元统计分析研究柑橘的香气物质，比较品种、压榨方式对香气物质种类和含量造成的差异，采用客观、科学的鉴定手段分析香气物质对柑橘果实香气品质的贡献程度，为柑橘果实品质评价和加工提供了参考信息。基于该研究结果，后续通过设计GC-O实验以及香气重组与缺失实验，将对特征香气物质进一步验证。除了主要赋香物质外，同时还需关注在果实香气构成中起协调、修饰和定香作用，且含量极少的化合物。