碳量子点/壳聚糖涂膜剂在芒果保鲜中的应用

肖丹,普红梅,田浩,杨德志,杨亚玲,李宏*

1(云南省农科院农产品加工研究所,云南 昆明, 650221) 2 (昆明理工大学 生命科学与技术学院,云南 昆明, 650500)

芒果原产于东南亚热带地区，风味独特，营养价值较高，特别是芒果所含有的VC和VA的前体胡萝卜素的含量特别高，有“热带水果之王”的美誉。芒果品种繁多，在我国云南、广西、广东、福建、台湾和海南等省份广泛种植，是我国极为重要的热带水果，经济价值较高[1-2]。芒果生长在高温高湿地区，果实容易受到微生物的侵染，其又属于呼吸跃变型水果，导致芒果不易存储，易于腐烂变质[3]。我国国土面积辽阔，很多水果需要从出产地运输到其他地方销售，而芒果的这一特点，造成芒果在运输和储存过程中发生较大损耗，严重影响芒果的经济效益[4]。目前，已有多种技术和材料被用于芒果采后保鲜，它们基本上都是从不同方面降低芒果的新陈代谢，以达到延缓芒果的失水、腐烂和褐变等目的。研究者多以壳聚糖、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠和魔芋葡甘聚糖等天然大分子多糖类材料为覆膜剂，与柠檬酸、CaCl2或抗坏血酸等材料进行复配，制备成复合涂膜保鲜剂对水果进行保鲜[4-7]。随着人们生活水平的提高，加强水果保鲜技术的研发，开发出安全、高效、低廉的芒果保鲜技术，对产业发展具有重要意义。

碳量子点(carbon dots, CDs)，是一种尺寸小于10 nm的碳纳米颗粒，与传统半导体量子点不同的是，它不会引起环境、健康及生物毒性问题[8]。碳量子点光学性质稳定，且表面富含多种官能团(如：羧基、羟基和羰基等)，易于实现表面功能化，从而使其具有一定的化学特性[9-11]。碳量子点具有良好的水溶性，优异的生物相容性，低毒性，出色的光稳定性和高量子产率，已经广泛应用于生物成像、化学传感和光催化等诸多领域[12]。目前，已有研究者利用光催化技术催化降解果蔬储藏期间产生的乙烯，并通过光催化作用达到抑制果肉褐变的目的[13-14]。但是将碳量子点应用于水果保鲜上的研究，尚未有所报道。碳量子点，除了在光催化、生物成像等领域已经得到广泛应用之外，也有研究者将碳量子点进行掺杂化学改性，而改性的碳量子点在微生物抑菌、杀菌方面表现出较大优势[15-16]。

此研究中，我们选择以海带作为碳量子点的合成材料，与天然大分子多糖，如壳聚糖、柠檬酸、抗坏血酸和CaCl2等材料进行复配，制备成纳米复合涂膜剂用于芒果保鲜，并通过各项指标研究其保鲜效果，以期为芒果保鲜提供新的技术方法与思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芒果，由云南省农业科学院农产品加工研究所提供，大小均匀、成熟度基本一致，并且表面无损伤、无虫害、未经化学药液处理；海带(市售)，购自附近超市，清水洗净后，备用。

壳聚糖、冰醋酸，均为国产食品级；柠檬酸、抗坏血酸、乙二胺、CaCl2均为分析纯，购自上海麦克林生物科技有限公司；黑曲霉(Aspergillusniger)，由北京北纳创联生物技术研究院提供。

1.2 仪器与设备

SX2-2.5-10高温马弗炉，重庆市松朗电子仪器有限公司；FA1004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；IKA RW 20 digital机械搅拌器，德国IKA集团；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；TU-19型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；pHS-3B酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司；VS-1300型洁净工作台，苏州净化设备有限公司；Tecnai G2 F20型透射电子显微镜，美国FEI公司；D/Max 2200型X射线衍射仪，美国Rigaku公司；Hitachi S-3400N扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 碳量子点的制备

称取20.0 g洗净的海带，剪碎，加入100 mL去离子水后打碎。然后加入0.5 mL乙二胺混匀，再将其转移到150 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中，置于马弗炉中，在180 ℃下反应6 h。待反应结束后冷却到室温，最后，所得溶液于10 000 r/min条件下离心20 min，接着用0.22 μm滤膜过滤以除去不溶性颗粒，即制得海带碳量子点溶液。

1.3.2 涂膜剂的制备

在弱酸性条件下(100 mL H2O中加0.2 mL冰醋酸)，将涂膜材料——壳聚糖溶解，并根据以下配比制备涂膜剂：涂膜剂Ⅰ，10 g/L壳聚糖；涂膜剂Ⅱ，15 g/L壳聚糖；涂膜剂Ⅲ，2 g/L壳聚糖；涂膜剂Ⅳ，15 g/L壳聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸；涂膜剂Ⅴ，15 g/L壳聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸+1.5%(体积分数)海带碳量子点(每100 mL涂膜剂溶液中含1.5 mL碳量子点溶液)；涂膜剂Ⅵ，15 g/L壳聚糖+4 g/L CaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸+3.0%(体积分数)海带碳量子点(每100 mL涂膜剂溶液中含3 mL碳量子点溶液)；

以不作处理的为对照组。

1.3.3 保鲜处理与测定方法

芒果经过自来水冲洗，晾干明水后，进行分组，每组50个。首先，将6组芒果分别放入不同的涂膜剂中，浸泡2 min，使涂膜剂均匀覆盖在芒果表面。捞出后，放于通风处自然晾干。将上述处理好的芒果放置于托盘，室温(25℃)下保存。对照组不作处理，直接放置于室温条件下保存。所有上述试验均重复3次。

上述芒果，每组分为2份，第一份30个，每天对其进行称重，并统计其腐烂个数，计算其腐烂率；第二份20个，用于测定分析芒果在储藏期间的生理生化指标情况。主要测定指标：(1)VC含量变化(2,6-二氯酚靛酚滴定法测定)；(2)芒果总糖(手持糖量计测量)和含酸量变化(滴定法测量)；(3)过氧化物酶活性[17]。

1.4 菌种的分离培养和抑菌试验

事先按照文献中方法配制LB培养基[18]和PDA培养基。试验中，以75%酒精、无菌水先后清洗芒果表皮3次，然后以无菌镊子取芒果表皮腐烂的部分，然后以5 mL生理盐水清洗腐烂表皮，此步骤重复3次，最后收集洗脱液(此过程在酒精灯火焰旁操作，防止空气中的微生物污染洗脱液)。

真菌的分离：取100 μL上述洗脱液，使用涂布环均匀接种到LB培养基上(在酒精灯火焰旁操作)，37 ℃倒置培养48 h，观察培养基上细菌和真菌的形态。再使用消毒牙签挑选培养基上的真菌转移到PDA培养基上于28 ℃培养箱中培养，并进行转接、纯化。将此纯化的真菌进行培养，作为真菌对照组Ⅱ。

试验分组：对照组Ⅰ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL无菌水，混匀备用。试验组Ⅰ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL碳量子点(2种不同浓度2.5 mg/L和5 mg/L)，混匀备用；试验组Ⅱ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL15 g/L壳聚糖溶液，混匀备用；试验组Ⅲ取5 mL上述含菌洗脱液，加1 mL15 g/L壳聚糖(含4 g/LCaCl2+4 g/L柠檬酸+5 g/L抗坏血酸)溶液，混匀备用；试验组Ⅳ取5 mL无菌水，加入1 mL碳量子点(浓度为5 mg/L)，混匀备用。

对于实验组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以及对照组Ⅰ，分别取100 μL的含菌溶液，使用涂布环接种到LB培养基上，37℃倒置培养48 h后，观察期抑菌效果。肉眼观察菌体生长情况，试验组有菌落生长则为无抑制作用，无菌落生长则为有抑制作用。对于试验组Ⅳ，取100 μL溶液，涂布于经过真菌接种之后的培养基上。观察真菌生长状况。

1.5 孢子萌发率的测定试验

采用孢子萌发法进行碳量子点的抑菌效果研究，在培养皿中间的凹玻片中分别加入50 μL的黑曲霉孢子悬液和50 μL不同浓度的碳量子点溶液，浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5和5 mg/L，28 ℃培养。每个玻片孢子总数为100个，当对照组孢子萌发率为70%～80%时，使用显微镜观察不同碳量子点浓度下孢子的萌发数，并计算孢子萌发抑制率,如公式(1)、(2)所示。

(1)

(2)

2 结果与分析

2.1 海带碳量子点的表征和芒果表面真菌形态的观察

图1-a为所制备的海带碳量子点的高分辨透射电镜图(TEM)，用于分析碳量子点的形貌和粒径分布。如图所示，海带碳量子点呈球形，尺寸均匀，且分散性好，平均粒径为3.1 nm。图1-a中插图显示，碳量子点的晶格间距为0.23 nm，与石墨烯的晶体结构相对应[19]。研究中，X射线衍射图谱(XRD)也被用于进一步研究海带碳量子点的组成。如图1-b所示，碳量子点在2θ=23.6°出现一个较宽的峰，这与石墨烯的结构相对应[20]。上述结果均表明，海带成功合成了碳量子点。图1-c为芒果表面分离纯化的真菌的扫描电子显微镜(SEM)图。芒果贮藏期病害主要是病原物，主要有曲霉病、炭疽病和蒂腐病等[21]。芒果曲霉病病原菌属于半知菌亚门，分别为黑曲霉和黄曲霉，其中黑曲霉最为常见[22]，通过与黑曲霉真菌形态等相对比，可知芒果表皮分离的真菌是黑曲霉。

a-碳量子点高分辨透射电镜图；b-碳量子点X衍射图谱；c-芒果表面的真菌扫描电子显微镜图；d-碳量子点对黑曲霉孢子萌发的抑制率图1 碳量子点和芒果表皮上真菌的表征与碳量子点对真菌的抑制效果Fig.1 Characterization of carbon dots and fungi, and inhibition effect of CDs on fungi

由图1-d可知，随着碳量子点浓度的升高，其对黑曲霉孢子萌发抑制率显著提高。当碳量子点浓度为5 mg/L时，孢子萌发抑制率为82.06%。

2.2 碳量子点的抑菌效果研究

图2-b和2-c所示分别为试验组Ⅰ中2.5 mg/L和5 mg/L的碳量子点的抑菌效果，发现与对照组Ⅰ相比，碳量子点的加入能显著抑制菌落的生长，并且随着浓度的增加，抑菌效果增加。与对照组Ⅰ相比，加1 mL 5 mg/L的碳量子点时，培养基表面已无细菌生长(见图2-c)；而加入1 mL 2.5 mg/L碳量子点时，仍有极个别菌落出现(见图2-b)。图2-d和2-e所示为抑菌研究试验组Ⅱ和试验组Ⅲ结果，发现壳聚糖具有一定的抑菌效果，可能原因是壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌作用的结果[23]。试验组Ⅲ的结果，从侧面说明CaCl2、柠檬酸和抗坏血酸的加入，并没有进一步提高抑菌效果。以上结果说明，海带碳量子点能有效限制芒果表面细菌的生长。

图2-f和2-g所示为真菌对照组Ⅱ和试验组Ⅳ的抑菌效果图。在相同条件下，加入5 mg/L的海带碳量子点之后，与对照组Ⅱ相比，抑菌效果明显，PDA培养基上只出现极个别菌落。此结果表明，海带碳量子点对芒果表面分离出的真菌有明显的抑制作用。

a-取自芒果表面的细菌培养结果(对照组Ⅰ)；b和c-碳量子点的抑菌效果图(试验组Ⅰ)；d和e-不同涂膜剂的抑菌效果图(试验组Ⅱ和试验组Ⅲ)；f-芒果表面真菌培养结果(对照组Ⅱ)；g-碳量子点对真菌的抑菌效果图(试验组Ⅳ)图2 碳量子点的抑菌效果研究Fig.2 Study on the antibacterial effect of CDs

2.3 涂膜剂对芒果理化指标的影响

2.3.1 不同涂膜剂对芒果失水率的影响

芒果水分的散失，会造成其表皮干瘪。由图3可知，经过不同的涂膜剂处理之后，会显著降低芒果的失水率。在室温保存8 d后，对照组芒果水分损失高达13.30%，而试验组中芒果水分损失最大也只有8.91%。保存18 d之后，试验组(涂膜剂Ⅴ)的芒果几乎无皱纹出现，而对照组芒果已出现明显褶皱且腐烂。结果表明，随着壳聚糖含量的增加，在一定程度上，保水效果也逐渐增加。但壳聚糖含量的增加，也会导致涂膜剂的黏度增加，涂层也变厚，涂布效果较差，不利于实际操作。在放置多天之后，2.0%壳聚糖含量的涂膜剂涂层变脆，轻微碰撞之后涂层即破损并出现裂纹。故研究中选择1.5%的壳聚糖作为成膜材料。

图3 不同涂膜剂对芒果失水率的影响Fig.3 Effect of different coatings on water-loss rate of mango

2.3.2 不同涂膜剂对芒果腐烂率的影响

芒果本身属于呼吸跃变型水果，再加上其生长在高温高湿的环境中，易于受到微生物、细菌等的侵扰，造成芒果不易储存，易于腐烂。试验中，我们分别用上述5种涂膜剂处理芒果。由图4可以看出，在放置20 d后，经过复配涂膜剂处理的试验组(腐烂率12.1%～22.3%)芒果腐烂率明显低于未经处理的对照组(腐烂率73%)。

图4 不同涂膜剂对芒果腐烂率的影响Fig.4 Effect of different coatings on rotting rate of mango

涂膜剂Ⅰ和涂膜剂Ⅲ处理10 d之后芒果保鲜结果表明，单独使用壳聚糖作为涂膜剂会出现褐变现象。与之相反，其他复配涂膜剂涂膜的试验组芒果则没有出现褐变。其原因可能是，CaCl2、柠檬酸和抗坏血酸的加入，能有效防止褐变产生[5, 24]。到第20天时，涂膜剂Ⅳ试验组腐烂率为22.3%，而涂膜剂Ⅴ和涂膜剂Ⅵ试验组在20 d后腐烂率才达到12.1%～13.4%。结果表明，加入少量碳量子点后，即能显著提高涂膜剂的保鲜效果。其原因可能是，碳量子点具有一定的抑菌、杀菌作用，能抑制或杀灭芒果表面可能存在的细菌等，从而降低芒果的腐烂率[14-15]。

2.3.3 VC含量的变化

贮藏期间，芒果中VC的含量，会随着时间的增长逐渐出现下降的趋势。由图5可知，经过不同涂膜剂处理的芒果，VC含量明显高于对照组。原因可能是，经过涂膜剂处理过后的芒果，表面会形成一层膜，在膜内层会形成低氧气、高二氧化碳浓度的环境，可以有效降低VC的氧化速度[25-26]。但单独使用壳聚糖作为涂膜材料时，与其他试验组相比，芒果中VC含量下降稍快。第8天时，涂膜剂Ⅱ试验组中VC含量为43.16 mg/100 g，涂膜剂Ⅳ试验组中VC含量为47.32 mg/100 g，而涂膜剂Ⅴ试验组中维生素含量最高，含量为54.22 mg/100 g。此结果说明，在壳聚糖成膜材料中复配少量碳量子点后，能进一步减缓芒果VC含量的降低。其原因可能是：一方面，通过在涂膜剂中加入抗坏血酸、柠檬酸和CaCl2，能有效抑制芒果的褐变反应，降低芒果中抗坏血酸的氧化[5, 22]；另一方面，可能是海带碳量子点具有一定的抑菌、杀菌作用，通过抑制或杀菌作用，降低细菌代谢产物的产生，最终达到延缓VC氧化的目的。

图5 不同涂膜剂对芒果中VC含量的影响Fig.5 Effect of different coatings on VCcontent in mango

2.3.4 芒果中总糖和含酸量的变化

芒果的呼吸作用会消耗总糖和酸，其含量的变化速度也可用来反映呼吸作用的强弱。芒果采后的贮藏期间，总糖含量首先会明显上升，达到一定峰值后会逐渐降低并趋于平稳。由图6可知，对照组在第4天总糖即达到峰值，而涂膜剂处理后，在第5天或6天总糖才到达峰值。相对来讲，涂膜剂Ⅴ和涂膜剂Ⅵ试验组中，芒果总糖达到峰值的时间比其他组稍慢，达到峰值后下降的趋势也相对缓和，保鲜效果最好。此外，由图7可以看出，在第8天时，涂膜剂Ⅱ、涂膜剂Ⅳ、涂膜剂Ⅴ和涂膜剂Ⅵ试验组含酸量，分别为0.38、0.48、1.39和0.53 g/100 g，对照组芒果含酸量仅为0.17 g，差异显著。酸度以柠檬酸计，每100 g样品。结果表明，涂膜剂能有效降低或延缓芒果中酸的转化与降解过程。

图6 不同涂膜剂对芒果中总糖含量的影响Fig.6 Effect of different coatings on total sugar content in mango

图7 不同涂膜剂对芒果中酸含量的影响Fig.7 Effect of different coatings on acid content in mango

2.3.5 过氧化物酶活性的变化

芒果在呼吸跃变之前，组织中存在许多酶抑制剂，酶活性的变化与呼吸作用密切相关。但芒果成熟后，组织中的酶抑制剂会逐渐失活，酶活性则会增加，最终会加快芒果的成熟。如图8所示，对照组芒果中过氧化物酶活性变化最大，而经过不同涂膜剂处理后，均能在一定程度上抑制过氧化酶的活性。

图8 不同涂膜剂对芒果中过氧化物酶活性的影响Fig.8 Effect of different coatings on peroxidase activity in mango

3 结论

本研究利用天然高分子多糖物质—壳聚糖为涂膜材料，和天然绿色的海带为碳量子点合成原料，先通过水热法制备海带碳量子点，然后再将少量碳量子点与柠檬酸、抗坏血酸和CaCl2等材料进行复配，制备出了碳量子点/壳聚糖涂膜剂。该涂膜剂能有效降低芒果的腐烂率和失水率，抑制了VC、酸和总糖含量的下降，延缓了芒果的后熟过程，最重要的是合成的海带碳量子点，能够有效抑制芒果表面的细菌和真菌的生长。并且，该种纳米乳涂膜剂制备简单、原料易得、无毒无害、天然绿色，对环境无污染，具有良好的保鲜效果。将无毒无害的碳量子点作为复配材料，应用于果蔬涂膜保鲜材料，具有很大的发展潜力。