酿酒专用粮基地酿酒玉米生长过程稳定同位素研究

张倩，谢正敏*，安明哲，魏金萍，叶华夏，黄箭

1(宜宾五粮液股份有限公司，四川 宜宾，644000)2(中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川 宜宾，644000)

酿酒原料的品质是白酒品质的基础，对白酒原料的控制直接影响到白酒成品的最终品质。酿酒生产通过长期经验发现，当地酿酒原料品种酿造的白酒具有独特的风味组成，使白酒成品截然不同于其他品牌产品。白酒公司通过建立“酿酒专用粮”种植基地对酿酒原料进行规模化统一种植，以加强对白酒原料的控制来提升保证公司白酒产品的品质[1]。玉米既是世界上人类栽种的重要粮饲兼用作物之一，也是五粮浓香型白酒的重要原料之一。研究者们对影响玉米生长、产量、品质的多方面因素都进行了深入研究[2-7]，但对酿酒专用玉米生长过程各部位碳、氮稳定同位素特征的研究却少有全面提及。分馏是稳定同位素的自然属性，同一植物不同生长时期不同部位之间的稳定同位素特征也会存在一定差异。近年来，随着稳定同位素技术的快速发展，该技术在各种植物不同部位的稳定同位素特征、植物是否有机种植等研究领域都有广泛应用[8-13]。而在玉米上，以往利用该技术的研究多只提到玉米某生长阶段一部分组织的稳定同位素特征[14-16]。本文利用该技术对“酿酒专用粮”种植基地酿酒玉米进行了不同生长阶段各部位碳、氮稳定同位素特征的跟踪分析，以加强对酿酒玉米生长过程的监控，进一步加强对酿酒原料品质的控制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

IAEA-600(咖啡因，国际原子能机构IAEA，基于V-PDB计算δ13C = -27.771 ‰，基于air N2计算δ15N =1.0 ‰)；锡盒(Thermo Fisher公司PN 24 006 400)；肥料(不同肥料δ15N差异大，范围广，本文所用肥料信息列于表1)。

GT200球磨仪，格瑞德曼；Delta V Advantage稳定同位素比质谱仪、Flash 2000-HT元素分析仪，Thermo Fisher公司。

样品：为跟踪检测酿酒玉米的生长过程，对“酿酒专用粮”种植基地的酿酒玉米(正红311)进行了植物不同生长时期的整株(包括根、茎、叶、果实等)取样，以进行稳定同位素研究，具体取样情况如下：

(1)标记位置不同的3块地，每个生长时期的酿酒玉米均在这3块地内取样，这3块地分别位于山顶、山中、山底，海拔总差值不超过200 m；山地区，地块面积小，每块地分别取3个不同点的土壤样(地面下10～20 cm取120～150 g)，分别充分混合，并标记为XJ-T-1，XJ-T-2，XJ-T-3；

(2)收集纯营养生长的3叶一心期(未移栽)玉米幼苗3份，编号XJ-1-1，XJ-1-2，XJ-1-3；

(3)在3个地点采集生长发育最旺盛的拔节孕穗期酿酒玉米(长出8～12片叶)各1株，编号XJ-2-1，XJ-2-2，XJ-2-3；

(4)在3个地点采集以生殖生长为中心的开花抽丝期酿酒玉米(雄穗抽出，雌穗苞叶中开始长出花丝)各1株，编号XJ-3-1，XJ-3-2，XJ-3-3；

(5)在3个地点采集生长发育完全结束的成熟酿酒玉米(可收割)各1株，编号XJ-4-1，XJ-4-2，XJ-4-3。

1.2 实验方法

对以上所取样品进行多部位取样、前处理，具体情况如下：

玉米植株取样分为：A根；B底茎(出土茎取3～5 cm)；C底叶(玉米茎最底1～2片老叶)；D中叶(玉米茎中叶片或玉米苞叶)；E顶茎(取顶叶下茎5～10 cm)；F顶叶(玉米茎顶的叶片或穗位叶)；G雄穗；H果实：I果穗；

土壤：自然风干3个地块的土壤样品，球磨仪研磨后待用。

玉米植株：分别摘取玉米植株各部位，蒸馏水清洗后，于烘箱60 ℃烘至恒重，球磨仪研磨后待用。

肥料：于烘箱50 ℃烘至恒重，球磨仪研磨后待用。

用锡盒包裹适量样品粉末，以IAEA-600为标准品、稳定尿素为质控样，采用元素分析-稳定同位素比质谱联用技术(EA-IRMS)检测样品；所述元素分析条件为：进样器He吹扫流量200 mL/min，氧化炉温度为960 ℃，柱温60 ℃，载气He,流量110 mL/min；稳定同位素比质谱条件如下：离子源真空为1.3×10-6mbar，电压为3.06 kV。

1.3 数据分析

在自然界中，13C/12C、15N/14N变化微小，难以测得其真实值，故采用相对测量法表示样品中13C/12C、15N/14N，结果以δ(千分差，‰)表示，如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

式中：Rsample C、Rsample N表示样品中13C/12C、15N/14N值；RV-PDB表示国际基准物质V-PDB的13C/12C值，13C/12C = (11 237.2 ± 90)×10-6；Rair N2表示空气氮库的15N/14N值，15N/14N = 0.003 68。本项目中所有数据均基于V-PDB、air N2计算。

2 结果与分析

2.1 酿酒玉米幼苗稳定同位素

酿酒玉米幼苗(未移栽)稳定同位素结果如图1所示：3个样品根、茎、叶的δ13C、δ15N均值并不完全相同，有细微区别，但因是在相同条件下、同一地块内进行的集体育苗，故均集中于-11.7‰～-13.2‰、3.4‰～5.7‰；对于碳稳定同位素，3个样品均表现出根>茎> 叶δ13C的趋势，这可能是因为在幼苗期，玉米主要是生根发芽，根部生长很快，地表部分发育速度缓慢，使得根部更有利于富集13C，符合C-4植物的碳稳定同位素特征；而氮稳定同位素不同于碳，表现出茎>叶> 根δ15N的趋势，这主要是因为植物通过根吸收的氮素一部分被根同化，由于14N活性优于15N，植物进行生命活动时会优先同化14N，使植物根氮稳定同位素偏负，剩余部分氮稳定同位素偏正[14]。

a-δ13C；b-δ15N图1 玉米幼苗稳定同位素Fig.1 The stable isotope ratios of maize seedlings

2.2 拔节孕穗期酿酒玉米稳定同位素

将集体育苗的酿酒玉米幼苗分别移栽，移栽土壤、施肥信息如表1所示。3个不同地块的土壤样各为每块地内3个不同点的土壤，各自拥有不同性状，每个样平行测量3次，取平均值。对拔节孕穗期酿酒玉米稳定同位素进行检测，3组样品每组平行测量3次，取平均值，检测结果列于图2。

表1 酿酒玉米移栽土壤、施肥信息Table 1 The soil and fertilization informations of liquor-making maize transplantation

移栽到3个不同土壤的拔节孕穗期酿酒玉米各部位δ13C均集中在-11.2‰～-13.7‰，与移栽前幼苗期相比并无明显差异，与3块地土壤δ13C(<-21‰)相比差异显著，这是因为植物δ13C受其光合碳代谢途径和环境因子共同影响[17]，以C-4循环为光合碳代谢途径的植物δ13C多集中于-11‰～-15 ‰，土壤碳稳定同位素组成对其不具显著性影响。图2显示3株酿酒玉米各部位δ13C均值的表现并不完全一致，底茎δ13C、根δ13C、中叶δ13C趋势不明显，但总的来说拔节孕穗期玉米叶、茎生长迅速，使得顶叶、顶茎更易富集13C，形成顶叶>顶茎>底茎、中叶、根>底叶δ13C的规律。

图2显示移栽后，3株拔节孕穗期酿酒玉米各部位δ15N分别处于-1.5‰～4 ‰、2.9‰～6‰、-2.8‰～0‰，与幼苗期(3.4‰～5.7‰)相比，各具差异；对比相应土壤及肥料δ15N均值，发现此时期酿酒玉米δ15N更受肥料影响；除了底叶δ15N规律不明显外，其他部位δ15N均表现出底茎>顶茎>顶叶>中叶>根δ15N的趋势。

a-δ13C；b-δ15N图2 酿酒玉米拔节孕穗期稳定同位素Fig.2 The stable isotope ratios of liquor-making maize at jointing-booting stage

2.3 开花抽丝期酿酒玉米稳定同位素

收集开花抽丝期酿酒玉米样品，对其各部位δ13C，δ15N进行检测，每个样品平行检测3次，取平均值，结果如图3所示。此阶段酿酒玉米各部位δ13C均集中在-11.0‰～-13.2‰，与前两时期相比并无明显差异。

a-δ13C；b-δ15N图3 酿酒玉米开花抽丝期稳定同位素Fig.3 The stable isotope ratios of liquor-making maize at flowering-silking stage

开花抽丝期酿酒玉米，所有叶片均已展开，植株定长，营养生长基本停止，进入以生殖生长为中心的阶段，此段时间营养集中累积到玉米植株的生殖器官(果穗、雄穗)上，使之快速生长。由图3可知，此时期酿酒玉米各部位δ13C均值均表现出果穗>雄穗>顶茎>顶叶>根> 底茎>中叶>底叶δ13C的趋势，说明处于快速生长状态的果穗、雄穗更易富集13C，形成穗>茎、叶、根δ13C的规律。不同于δ13C规律，开花抽丝期酿酒玉米各部位δ15N均值均表现出底茎>底叶、中叶>顶茎、果穗>顶叶>雄穗>根δ15N的趋势，总的来说呈现茎、叶>穗> 根δ15N的规律。

2.4 成熟期酿酒玉米稳定同位素

收集了成熟酿酒玉米样品，此阶段底叶、中叶均已干枯掉落，故没收集底叶、中叶数据。成熟期酿酒玉米干物质积累已停止，植株主要是脱水，可观察到收集到的样品多部位已干枯发黄，但籽粒生长状况比较好。对样品其余各部位δ13C、δ15N进行检测，每个样品平行检测3次，取平均值，结果示于图4。此阶段酿酒玉米各部位δ13C均集中在-11.3‰～-13.0‰，与前三时期相比并无明显差异。图4显示，山顶、山中、山底3块地上的成熟期酿酒玉米各部位δ13C均值均表现出果实>雄穗>顶茎>根>底茎>顶叶δ13C的趋势，说明经过整个生命过程后，酿酒玉米的果实富集到最多13C，形成果实>茎、根、叶δ13C的规律。而酿酒玉米各部位δ15N均值，除了根δ15N规律不明显外，其他部位表现出底茎>果实>顶叶>顶茎>雄穗δ15N的趋势。

a-δ13C；b-δ15N图4 成熟期酿酒玉米稳定同位素Fig.4 The stable isotope ratios of liquor-making maize at maturity stage

另外，采集了3块地上其他酿酒玉米植株的果实样品各2个，平行检测3次，取平均值，检测结果列于图5。由图5可知，山顶、山中、山底酿酒玉米果实δ13C 波动不大，均集中于-11.9‰～-11.2‰；而果实δ15N显示出不同现象：同一块地内，3个果实δ15N波动不大，但不同地内，果实δ15N差距明显；山顶、山中地内酿酒玉米果实δ15N均大于+2.0 ‰，而山底地内酿酒玉米果实δ15N均小于-1.5 ‰。这是因为山顶、山中田地施有机肥，而山底田地施非有机肥；研究表明非有机肥δ15N约为-2‰～2‰，有机肥δ15N约为0.6‰～36.7 ‰[18]，过多使用非有机肥会使植物δ15N贫化，而有机肥对15N有富集作用，植物利用后，15N会进一步富集，造成3块地内酿酒玉米果实δ15N表现不同。

a-δ13C；b-δ15N图5 酿酒玉米果实稳定同位素Fig.5 The stable isotope ratios of liquor-making maize fruits

3 讨论

檀文炳等[19]发现北京东灵山(海拔400～2 300 m)C-4植物叶片δ13C随海拔高度的增加逐渐变重，酿酒玉米属于C-4植物，在图2拔节孕穗期中也表现出相似的规律：各部位δ13C均随着海拔高度的增加(从山底XJ-2-3到山顶XJ-2-1)逐渐变重，这可能是因为随着海拔高度的增加，环境大气压下降，植物叶片内外CO2的分压差异变小，造成植物体内碳稳定同位素的分馏作用变小，最终造成这一规律[20]。然而这一规律并未在图3开花抽丝期和图4成熟期中出现，这可能是因为除了海拔高度，植物δ13C还受到压力、光照、可利用水量、温度等因素影响[20]，虽然3个取样地点没变，但随着取样时间从初春逐步过渡到夏天，3个取样地点的其他环境因素出现了不一样的变化，使得海拔高度因素在这2个生长时期未对酿酒玉米δ13C造成显著影响。总之，海拔高度在本文中未对酿酒玉米δ13C产生显著影响。

表2显示不同生长时期酿酒玉米拥有不同稳定同位素规律，总的来说，13C最易富集在生长旺盛的部位；而15N/14N最易在茎部(特别是底茎)富集(与以往研究[14-15]的结果一致)，在根部贫化。

表2 不同生长时期酿酒玉米稳定同位素规律Table 2 The stable isotope ratio regularities of liquor-makingmaize at different growth stages

酿酒玉米移栽不同土地、施不同肥后底茎、底叶δ15N的情况如图6所示。纵观酿酒玉米整个生长过程，发现在集体育苗的幼苗期，酿酒玉米茎、叶δ15N分布集中，无明显区别；移栽到不同土地、施不同肥后，各部位δ15N出现了不同分化：其他部位δ15N分化不具明显趋势，而底茎、底叶δ15N，无论是在拔节孕穗期，还是在开花抽丝期，施有机肥的山顶、山中地内，其都如果实δ15N一般大于+2.0 ‰，施非有机肥的山底地内，其均小于0 ‰。综合图5、图6结果，说明酿酒玉米底茎、底叶和果实δ15N对施肥情况比较依赖：多施有机肥，有利于酿酒玉米富集15N/14N，使底茎、底叶、果实δ15N偏高；多施非有机肥，不利于酿酒玉米富集15N/14N，使底茎、底叶、果实δ15N偏低。这与CHOI等[15]的研究结果“种植70 d后，施有机肥(猪粪肥)的玉米叶片δ15N和玉米粒δ15N明显高于施非有机肥(尿素)；施不同肥的玉米根δ15N、茎δ15N的差异不显著”不完全一致。造成本文与CHOI等[15]在玉米茎δ15N结论上不一致的可能原因有：种植环境条件不一样，本文是在多变的实际种植环境中进行的，CHOI等[15]是在稳定的实验室种植环境中进行的；取玉米茎的位置可能不一样，本文在顶茎δ15N和底茎δ15N上的结论就不同。

a-酿酒玉米底茎δ15N;b-酿酒玉米底叶δ15N图6 酿酒玉米底茎、底叶δ15NFig.6 The δ15N in bottom stem and bottom leaf of liquor-making maize

4 结论

随着消费者对浓香型白酒品质要求的提高，研究者们不断地深入对浓香型白酒原料和生产工艺的研究，酿酒原料的品质直接影响着浓香型白酒的品质。肥料的差异导致了酿酒玉米底茎、底叶、果实δ15N的表现不同；生长过程中的同位素自然分馏效应导致了酿酒玉米各部位δ13C在不同生长时期的不同差异。本文在对酿酒专用粮食基地玉米生长过程的监控中，提供了初步理论数据；并在加强对白酒原料品质的控制，进而加强对浓香型白酒品质的控制中，贡献了一份力量。鉴于本文是在酿酒玉米单次施肥条件下得到的结果，故要实现这个监控可能性还需收集更多更细致的实验数据，如酿酒玉米植株在不同生长时期施不同肥后，不同部位δ15N的表现以及土壤硝态氮δ15N、铵态氮δ15N、有机氮δ15N、营养物质含量的变化等。