牛结核病流行现状与诊断技术研究

李少晗，崔尚金，秦彤

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.兽用药物与兽医生物技术北京科学观测站，北京 100193）

牛结核病 （Bovine Tuberculosis） 是由牛型结核分枝杆菌（Mycobacterium）引起的一种慢性消耗性人畜共患病。在我国，牛结核病属于二类动物疫病。结核病作为全球性的健康问题，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，在世界范围内有三分之二的人、即20亿人口被其感染，每年导致800万人发病，200万～300万人死亡。我国的结核病流行一直十分严重，其严重性仅次于印度，居世界第二位[1]。

牛结核病的传染流行不仅阻碍着奶牛业的发展，而且还关乎人类生命健康。杨醉宇等[2]的研究发现，患结核病的牛中有9.5%是由人结核分枝杆菌感染引起的，而在患结核病的病人中有10.6%是由牛分枝杆菌感染引起的，所以人、牛之间存在一定的互感性。早在1960年世界卫生组织 （WHO） 专家委员会第七次会议就指出：在那些还存在牛结核病流行的国家中，人类始终受到该病的威胁，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的[3]。

1 流行病学研究

1.1 传染源及传播途径

奶牛患病之后，结核分枝杆菌可随鼻液、涎液、粪便和乳汁等排出体外。传播途径可以分为四种类型[4]：①空气传播。牛结核病主要通过呼吸道进行传播，规模化养殖场的养殖密度很大，空气传播导致发病的概率最高。②经口传播。牛结核分枝杆菌具有很强的体外存活能力，牛结核杆菌耐干燥、耐湿冷、耐酸碱，在干痰中可以存活10个月，可在水中存活5个月。动物将病原菌排出体外，会污染饲料和饮水，病牛的牛奶也是重要的传染源。③撕咬传播。患病动物的唾液和鼻液中结核杆菌含量很高，处于发情期的动物会为了争夺伴侣互相撕咬造成传播。④垂直传播。怀孕的母牛可以经过胎盘传播给胎儿，造成新出生的小牛感染结核杆菌。

1.2 易感动物及感染途径

奶牛对牛结核分枝杆菌最易感，山羊、绵羊、猪、人和灵长类动物都对其易感。犬可以作为牛结核分枝杆菌的中间宿主。病牛产生飞沫，污染空气环境，牛及人可通过呼吸感染。健康牛进食被污染后的牧草和饮水后经消化道感染。人主要是通过消化道被感染，如吃未经检疫或检疫不合格非正规厂家的结核病患牛的肉制品，或是饮用未经巴氏消毒或煮沸的结核病患牛的奶。某些养殖场为了减少经济损失，将病牛的牛奶喂牛犊造成犊牛感染。

1.3 流行病学调查

1985年、1987年两次全国奶牛抽样调查中，牛结核病患病率分别为5.38%和5.43%。2001年对全国26个省市奶牛进行的调查中，其中有些省份的奶牛结核病患病率高达10.18%；2002年全国多个省市调查表明，患病率超过1%的省份有10个，个别省高达7%。张喜悦等[5]2016年利用实验室制备的TB γ－干扰素 ELISA 诊断试剂盒对我国北方33个奶牛场进行结核病检测，结果显示个体阳性率为13.99%，群阳性率为51.51%，其中牧区、郊区和农区的个体阳性率分别为0、13.32%和23.81%，牧区的阳性率显著低于郊区和农区。韩猛等[6]2010～2012年通过IFN-γ释放试验对山东省不同地区规模化奶牛场中的1 678头奶牛进行牛结核病流行病学调查，结果表明2010、2011和2012年年平均阳性率分别为35.42%、29.27%和25%。郭开彬[1]2008年左右利用经典PPD皮内变态反应试验对四川省成都市双流县1 283头奶牛进行结核病检测，其阳性率为25.57%，并且调查发现县城内养殖场和距离大都市较近的大型养殖场阳性检出率明显高于距离城市区较远或位于偏远丘区镇的小型养殖场。阳爱国等[7]2012年对四川省奶牛结核病调查结果显示平均阳性率为1.56%。2016～2017年，阳爱国等再次对四川省主要奶牛养殖地区结核病进行调查，共调查了81个养殖场（户），其中包括15个规模场、17个适度规模场、49个散养户，结果显示阳性场占4.94%，规模场的个体阳性率为0.08%，适度规模场及散养户的个体阳性率为0.14%。石琴，袁立岗等[8]在2012～2018年每年的4月份和10月份，利用结核菌素PPD皮内变态反应试验对新疆乌鲁木齐市近郊的6个奶牛养殖小区进行奶牛结核病流行病学监测，连续7年累计检测奶牛56 668头，结果显示，平均阳性率由2012年的1.49%下降到2018年的0.33%，并且有2个奶牛养殖小区达到了国家标准结核病净化水平，取得了预期的防控效果。但仍有少数奶牛养殖小区结核病阳性率偏高，需要继续实施严格的防控措施，争取完成该地区奶牛结核病的净化。王云霞等[9]对1996～2005年陕西汉中市奶牛结核病的检测数据进行了统计分析，结果显示伴随着该地区奶牛存栏数的不断上升，奶牛结核病阳性检出率亦有所上升，10年内在1997～1998年和2000～2001年两个时间段汉中市阳性检出率有所下降，但10年内总体是呈上升趋势的。通过以上流行病学调查说明不同地区奶牛结核病发病率不同，存在着明显的地域差异，近些年来总体流行呈上升趋势。

1.4 流行原因及分析

1.4.1 养殖场位置、规模

郭开彬等的调查结果显示，距离中心城市区或者副城市区较近的、发展较早、交通发达便利、牛只流动频繁的养殖场其结核病阳性率明显高于发展慢、规模小、偏远乡镇的养殖场。阳爱国[7]的调查结果显示规模场的阳性率低于适度规模场和散养户，这是由于规模场较适度规模及散养户在圈舍选址、建设布局等方面设计更加科学，隔离、消毒等措施实施更加到位，厂区管理制度更加标准、严格。通过张喜悦等[5]的研究结果发现，在北方地区牧区的阳性率显著低于郊区和农区，可能是因为牧区牛饲养密度相对较小，并且在放牧饲养条件下，牛只运动量较大，可以增强机体免疫力，同时牧区气温干燥、日照时间长，由病畜排出的结核杆菌不能长期存活，所以感染率通常较低[10]。

1.4.2 养殖场的消毒、管理及环境因素

某些养殖场( 户) 结核病流行的主要原因可归结为：工作人员进入场区不洗澡、不更换衣服、不换胶靴等；场内仅采用喷雾方式消毒，消毒工作不到位；共用挤奶器；饲料饮水质量不合格；粪便没有无害化处理造成土壤污染；混饲养其他动物等。2017年北京市密云区某奶牛养殖场结核病阳性率高达29.5%，调查发现其感染因素可能是饲喂从疫区购进的牧草[11]。

1.4.3 奶牛流动及隔离情况

养殖场引进或者销售奶牛较频繁，多数奶牛场无专用的隔离场或隔离场建设不合理，部分奶牛场引进牛只时未经检疫就直接混群饲养，很容易造成不同地区疫病的传播感染。

1.4.4 员工认识与技术培训水平

部分奶牛养殖场内员工学历较低、年龄较大，对结核病的危害认识严重不足，专业技术水平偏低，场内缺少专业相关的驻场兽医，乡镇技术人员技术不扎实等，也是造成牛结核病流行的因素之一。

1.4.5 政府监管、处理措施

目前相关养殖场和业务部门对该疾病的检测积极性不够高，检测技术不达标，没有坚持每年春、秋两次对奶牛检测进行全面覆盖。我国规定，只要结核菌素PPD皮内变态反应试验为阳性，就应严格执行扑杀和无害化处理。但由于试验时受环境温度、湿度、试剂质量及操作人员的技术水平和经验等因素影响，试验结果难免有误差，可能出现假阳性和假阴性现象，应配合使用γ-干扰素体外释放ELISA方法。目前，我国相关政府部门对无害化处理的结核病阳性牛给予6 000元/头的补助，但现在一头成年高产奶牛市场价格在15 000元以上，一头奶牛按年产5t鲜奶、1t鲜奶3 500元计算，年生产效益至少17 500元，因此农户无法承受淘汰处理带来的经济损失，存在隐瞒不上报继续治疗饲养或者私自销售的现象。

2 主要诊断检测技术

2.1 细菌学检测方法

细菌学检测主要包括涂片抗酸染色法和细菌分离培养方法。涂片抗酸染色法简单、快速，借助显微镜便可进行，不受环境的限制，但是这种方法对结核杆菌的准确检出率较低，容易出现假阳性[12]。细菌分离培养通常采取痰液等呼吸道分泌物作为病料进行培养，由于结核分枝杆菌培养时间长，一般需要8周时间，且有10%～20%的病例可能培养失败，而且存在实验室操作人员接触活菌的危险，所以一般不采用此方法。

2.2 免疫学检测方法

免疫学诊断主要包括结核菌素PPD皮内变态反应、IFN-γ体外释放ELISA试验、免疫胶体金技术等方法，目前此类方法应用最为广泛。

牛结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，在机体免疫初期诱发细胞免疫，细胞免疫随病情的加重而减弱。随着机体抵抗能力的降低，结核分枝杆菌开始向外扩散，进入血液和体液中，诱导机体发生体液免疫，体液免疫随病情的加重而增强。结核菌素PPD皮内变态反应是检测细胞免疫的方法，IFN-γ体外释放ELISA是检测体液免疫的方法，从理论上讲，皮内变态反应与IFN-γ体外释放ELISA方法的阳性结果并不一定吻合。因此，实际检测中只采用皮内变态反应或IFN-γ体外释放ELISA方法是不合理的，并不能检测出全部的阳性牛，也可能会造成假阳性结果。应以结核菌素皮内变态反应检测为主，以牛结核γ-干扰素ELISA试验检测进行复核，以提高检测准确率，避免产生假阳性。

2.2.1 PDD皮内变态反应

PDD皮内变态反应试验是目前临床上用于牛结核病检测最常用的方法，也是世界动物卫生组织（OIE）对牛结核病检疫的指定方法。此方法操作简单，非专业的基层工作者也能掌握。但是工作量大、检测时间长，而且实际操作中的人为以及非人为的因素造成的误差都会使该方法的敏感性和特异性降低。非典型分枝杆菌感染、某些寄生虫病和药物作用等非特异性因素均可造成皮内变态反应假阳性，但是这些非特异性因素产生的体液免疫水平很低，所以IFN-γ体外释放ELISA试验能够排除这些因素的影响。

2.2.2 IFN-γ体外释放试验

该方法比结核菌素PPD皮内变态反应的敏感性更高。IFN-γ体外释放ELISA试验不仅避免了分析试验结果时的主观性，而且相较于周期较长的检测方法，如细菌培养、结核菌素皮内变态反应等，一次采集血液即可完成检测，可有效降低工作量，同时检测也更加快速、准确、高效。奶牛结核病检疫中，许多皮内变态反应检测为阳性的牛扑杀剖检后看不到典型的结核性病理变化，有的复检也不再出现阳性反应，由此导致误杀了假阳性的牛，造成很大的经济损失。ELISA试验正好弥补了这一缺点，在感染后期细胞免疫水平降低，进入体液免疫阶段后，ELISA试验的准确检出率要比变态反应高得多，而且试验结果与剖检结果也较为符合。

2.2.3 免疫胶体金技术

该方法具有操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高、可直观判断结果、结果易于长期保存、无需特殊仪器设备和试剂等优点，免疫胶体金技术特别适用于野外工作、大面积普查或大批量时间紧的检测。由于免疫胶体金技术起步较晚，市面上用于临床诊断的胶体金相关试剂盒还不多，但该技术拥有巨大的发展潜力和应用前景是毋庸置疑的[13]。只是由于胶体金技术是通过检测疾病后期体液免疫产生的抗体来得出结果的，故对早期感染病例检出率不高。

2.3 分子生物学方法

该类型主要包括核酸探针、PCR和DNA图谱等方法。这些方法具有敏感度高、特异性强等优点，成为目前应用于结核病检测的新方法。但由于分子生物学检测需要特殊、昂贵的仪器设备，操作技术相对于皮内变态反应和ELISA试验较为复杂，对实验室条件和操作人员的要求较高，因此只适用于实验室研究，还不能够用于基层的推广应用。张曼等[14]选取了牛结核分枝杆菌复合物的插入序列IS6110基因序列设计引物，建立了牛结核病的PCR检测方法。IS6110基因是结核分枝杆菌复合群的一个转座基因，在分枝杆菌属其他菌种中不存在，因此利用该序列作为扩增靶序列，可以将结核分枝杆菌与其他细菌区分开来。

3 展望

牛结核病是一种慢性消耗性人畜共患病，目前其在全世界广泛分布，在人和家畜间传染性较强，严重危害人类健康和奶牛养殖业经济发展。在养殖环节，场内要做好严格的消毒、隔离工作、采取严格的免疫、驱虫等措施，每年积极配合春、秋两季的结核病筛查，发现阳性病例，要立即上报，执行扑杀无害化处理，并对可疑牛及检测阴性牛做好隔离、监督工作，同时配合药物预防。在研究环节，研究者应积极开发灵敏度高、特异性强的核酸探针、PCR等新型检测方法是未来重要的研究方向。期待有更加高效、准确、快速并且方便使用的检测方法，为人与牛结核病的防控以及进一步的净化提供帮助。