神经型布鲁氏菌病的发病机制、诊断方法及预防

赵婷婷，赵世刚,2，苏 霄，刘 丹

布鲁氏菌为长0.5～1.5μm，宽0.4～0.8μm，无芽孢、无鞭毛、非运动性、光滑型菌株有微夹膜、兼性寄生的胞内革兰阴性球杆菌。布鲁氏菌属由 Meyer和Shaw于1920年建立，目前由6个物种组成，分别为B.melitensis(主要感染山羊、绵羊及骆驼)，B.abortus(主要感染牛)，B.suis(主要感染猪)，B.canis(主要感染狗)，B.ovis(主要感染绵羊和公羊)，B.neotomae(主要感染沙漠木鼠)，新发现的物种包括以下6种：B.ceti(主要感染鲸豚类)，B.pinnipedialis(主要感染鳍足类海洋生物)，B.microti(主要感染普通田鼠)，B.papionis(主要感染狒狒)，B.vulpis(主要感染啮齿类)及Brucellasp(主要感染红狐)，非典型菌株包括：B.inopinata(BO1分离于乳房伤口中感染的植入物中)，B.inopinata(BO2分离于1名慢性破坏性肺炎的患者身上)及近年来从非洲牛蛙等冷血寄主体内分离出的布鲁氏菌株[2],前6种也被称为核心布鲁氏菌属，其中前3种是重要的人兽共患病病原体，感染人类后称为布鲁氏菌病。目前，这些新发现的物种和非典型菌株对人类的致病性尚不清楚，但不能排除对人的致病性。

1 流行病学

布鲁氏菌病为全球性疾病，据报道，每年有50万例人布鲁氏菌病病例，然而，实际发病率估计每年为500万至1 250万例[1]。它常见于地中海盆地、东欧、南美和中美洲、亚洲、非洲、中东和加勒比地区。根据世界动物卫生信息数据库，2014年墨西哥报告的疫情数量最多，为5 514起，紧随其后的是中国(2 138人)、希腊(1 268人)和巴西(1 142人)。中国疾控中心的数据显示，该病的年发病率已从2002年的5 000例上升到2015年的6万多例。在我国，如新疆、内蒙古、青海、宁夏、西藏、陕西、吉林等地发病率较高，其他非牧区省市也有该病散发情况[3]。与人类有关的主要传染源是羊、牛及猪，其次是犬、鹿、马、骆驼等。传播途径包括：经皮肤及黏膜接触，经消化道传播，经呼吸道传播，以及其他经苍蝇携带、蜱叮咬传播[4]。性别、民族、地域分布与布鲁氏菌病患者神经系统损害无显著性差异，而年龄的增长以及疾病持续时间的延长与布鲁氏菌病患者神经系统损害有统计学差异[5]。Mediha等研究发现工作人员在处理流产或分娩过程中的雌性反刍动物时可增加布鲁氏菌病的发病率[6]。

2 发病机制

布鲁氏菌病及神经型布鲁氏菌病的发病机制较为复杂，细菌、毒素以及变态反应均有不同程度地参与疾病的发生、发展过程。了解布鲁氏菌病的发病机制将有助于更好的理解神经型布鲁氏菌病的发病机制。最新发现的可能机制包括以下几种。

2.1 布鲁氏菌病的发病机制

2.1.1免疫机制 在Rongjiong Z等的meta分析中表明,人类布鲁氏菌病患者的CD4+T细胞比例显著下降，而CD8+T细胞比例增高，CD4+/CD8+比值显著下降[7]，CD4+T淋巴细胞功能障碍与慢性布鲁氏菌病有关，CD8+T在复发或有症状的患者中明显增多。Rafiei 等发现，慢性布鲁氏菌病患者外周血中分泌干扰素-γ的T淋巴细胞比例明显低于急性期患者，而产生IL-13的T淋巴细胞比例明显增加，同时Th1/Th2比例失调，Th2细胞分泌的细胞因子增多。布鲁氏菌表达免疫原性OVA(鸡卵清白蛋白)，研究表明表达针对OVA peptide SIINFEKL的TCR可变区域的转基因小鼠称为OT-1，OT-1 TCR转基因T细胞可通过OVA-TCR对感染的布鲁氏菌触发强烈的细胞因子和CTL反应，CD8+T细胞识别OVA-TCR，但这些OVA-TCR被MHC-II呈现的不连续五聚体覆盖，并被CD4+T细胞识别，具有相似程度的潜在交叉反应活性[8]。研究报道，细胞因子具有活化巨噬细胞的功能，布鲁氏菌表面蛋白Omp25除了下调TNF-α外，还能抑制LPS-induced白介素PAMs p40和IL-6表达[9]，从而抑制巨噬细胞的活化，也就失去了巨噬细对布鲁氏菌的免疫功能，导致感染慢性化。Yuehua等认为BrucellaVirB T4SS是一种重要的毒力因子，能够调节细菌细胞内存活和控制宿主对感染的免疫反应[10]。

2.1.2其他机制 在Hull等一文中发现[1]，赤藓糖醇是由妊娠动物的胎盘组织产生的，可被布鲁氏菌用作生长刺激因子和碳源，优于葡萄糖。从胎盘释放的赤藓糖醇进入循环系统导致布鲁氏菌从淋巴结转移到生殖组织，重点侵犯绒毛膜绒毛，并且延伸至胎盘胎儿侧的子叶，在此细菌大量繁殖(1 013个细菌/克组织)，诱导炎症细胞浸润，滋养细胞坏死，导致血管炎，这最终导致胎儿-母体代谢交换受损，导致胎儿流产。流产事件中排出的胎儿和胎盘组织及相关液体是动物种群中的主要传染源，根据环境的适宜性(湿度、土壤组成、温度、紫外线照射等)，这些布鲁氏菌可存活长达一年。Elodie等研究发现小鼠在感染B.abortus和B.melitensis48 h后可诱导不同类型细胞(包括髓细胞和非髓细胞)的线粒体发生快速分裂，这种分裂影响布鲁氏菌繁殖和TNF-α诱导的细胞凋亡[11]。Elias等建立的小鼠模型中发现，布鲁氏菌具有致病性的双组分系统RegB/A，在控制及适应缺氧环境和体内持久感染方面发挥着重要作用[12]，这也是慢性感染及临床耐药的机制之一。Tayse等研究表明B.canis在胎、新生儿组织巨噬细胞中广泛分布，但也可侵袭体内不同种类细胞，包括肠上皮细胞、肾小管上皮细胞、脂肪细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、脉络丛细胞、子宫肌层细胞、骨细胞、成骨细胞、滑膜细胞、肝细胞和胶质细胞等。青少年患有布鲁氏菌病伴有canis4型动脉瘤的报道提示，可能是由于平滑肌细胞直接感染所致[13]。另有研究发现，结核杆菌可能导致人体内巨噬细胞功能障碍、贫血和低蛋白血症，这使得结核病患者更容易感染布鲁氏菌病[14]。

2.2 NB的发病机制

2.2.1布鲁氏菌直接或间接侵入血脑屏障 Miraglia等发现，采用体外人血脑屏障即人大脑微血管内皮细胞BBB模型研究B.abortus与大脑血管内皮细胞的相互作用，发现尽管B.abortus能够侵入HBMEC并在HBMEC中复制，但细菌本身不能通过HBMEC，而是通过受感染的单核细胞以极化状态穿过HBMEC单层膜，同时布鲁氏菌还可以利用屏障细胞间的非细胞迁移穿越HBMEC。重要的是，通过HBMEC单层的受感染单核细胞是胶质细胞感染的细菌来源[15]。B.abortus能够粘附和侵袭HBMEC，这依赖于真核细胞的微管、微丝、核内体酸化和从头合成蛋白，近年来，肌动蛋白重组被认为是布鲁氏菌对胎鼠上皮细胞侵袭、内化和细胞内转运的关键因素。

2.2.2血脑屏障和激活和/或功能障碍 中枢神经型布鲁氏菌病的发病机制多数与血脑屏障(HBMEC)的激活和/或功能障碍有关，Miraglia等研究发现感染布鲁氏菌的人类神经胶质细胞分泌IL-1b和TNF-α，但HBMEC的激活依赖IL-1b免疫介导[16]，最终导致HBMEC内皮细胞破坏，血管通透性增加，中性粒细胞及单核细胞迁移，引起中枢神经系统感染。

2.2.3蛋白激酶通路的激活 大量研究报道布鲁氏菌感染人体后可诱导机体产生炎性细胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)，细胞因子通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，使星形胶质细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)，B.abortus表面蛋白L-Omp19或Pam3Cys也可以激活p38和Erk1/2 MAPK通道诱导星形胶质细胞分泌MMP-9[17]，MMP是一类钙和锌依赖的蛋白酶，尤其是MMP-9可以降解血脑屏障和中枢神经系统组织中的许多结构成分，包括IV型胶原蛋白、椎板蛋白和纤连蛋白。

2.2.4先天免疫细胞受体上调 Kim等研究发现，感染B.melitensis的猕猴白质星形胶质细胞TLR2表达增加，导致先天免疫激活增加[18]。

2.2.5神经细胞脱髓鞘 另外有学者认为慢性神经型布鲁氏菌病是免疫介导的脱髓鞘病变[19]。

2.2.6神经节苷酯抗体形成 动物实验模型中发现，布鲁氏菌表面的神经节苷酯类似物刺激抗神经节苷酯抗体(GM1)形成，最终导致肌无力及共济失调症状[20-21]。

3 临床表现

3.1 布鲁氏菌病的临床表现

3.1.1全身表现 布鲁氏菌病的全身症状无特异性，可表现为发热、疲乏无力、大汗、关节疼痛、食欲下降、体重下降、头痛、肌肉疼痛、抗利尿激素综合征[22]、腰痛及神经系统受损等表现[5,23-24]，其中最常见的症状为头痛及发热。

3.1.2局部表现 局部可表现为肝脾肿大、关节炎、感染性心内膜炎及起搏器后心内膜炎等。

3.2 NB的临床表现

3.2.1NB的主要临床表现 NB的临床表现复杂多样，主要表现为脑膜炎、脑膜脑炎、脑脓肿、硬膜外脓肿、肉芽肿形成、假性脑瘤形成、脊髓炎、神经根神经炎、颅神经受累、癫痫、精神障碍及血管受累症状(静脉窦血栓、缺血性脑卒中及动脉瘤)等。

3.2.2其他罕见表现 NB偶可见孤立性颅内压增高，格林巴利综合征，颅后窝脓肿、硬膜下出血及弥漫性脊髓蛛网膜炎等。在赵世刚等的临床研究提示周围神经型布鲁氏菌病较中枢神经型布鲁氏菌病常见，且感觉神经较运动神经易受累，同时总结出周围神经型布鲁氏菌病临床表现主要包括四肢末端对称或不对称性麻木、痛觉过敏及发凉、烧灼感等，肢体腱反射减退或消失，肢体无力、瘫痪及肌肉萎缩等，其次为听神经、面神经及动眼神经损害，并得出周围神经型布鲁氏菌病电生理改变既有脱髓鞘损害又有轴索损害[5,23]。

4 诊断方法及进展

结合流行病学接触史、症状、体征及辅助检查可确诊。目前大多数国家使用的辅助检查仍然为标准试管凝集试验、抗人球蛋白试验、虎红平板凝集试验、硫醇基试验、酶联免疫吸附试验和布鲁氏菌培养等传统方法，但鉴于传统方法的特异度、灵敏度及实验室污染等问题，目前聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术为检测布鲁氏菌提供了一种灵敏、特异的方法[25-26]。1990年，Fekete等首次提出了基于PCR的布鲁氏菌病检测方法。Baddour等比较了布鲁氏菌的3对引物扩增3个不同片段的敏感性，其中包括编码BCSP31(b4/b5)的基因、16SrRNA序列(f4/f2)和OMP2的基因(jpf/jpr),结果表明，B4/B5引物对、JPF/JPR引物对和F4/R2引物对的敏感性分别为98%、88.4%和53.1%。Kattar等利用16-23S ITS、OMP25和OMP31的杂交探针和引物，开发了3种实时PCR(real-time PCR)技术，用于在属水平上诊断人类布鲁氏菌病,结果表明，以16S-23S为引物和探针的实时PCR反应灵敏度最高[27]。此外，一项研究分析了利用引物和针对IS711、BCSP31和PER基因的TaqMan探针建立的3种实时PCR方法的敏感性和特异性，结果表明，基于IS711的实时PCR检测布鲁氏菌最灵敏、特异及高效[28]。Rabehi等研究表明，乳汁中的布鲁氏菌排泄量较低，但足以引起感染，以布鲁氏菌IS711插入序列为引物，使用real-time PCR检测牛奶样本中的此序列，似乎比血清学检测有优势，使用这一程序可以作为农场动物的常规筛选试验[29]。众所周知，布鲁氏菌病和肺外结核的某些局灶性并发症很难在临床、生物学和放射学上加以鉴别，多重实时PCR(multiplex real-time PCR, MRT-PCR)是PCR的一种变体，比实时PCR诊断更加准确，能够同时测序2个或多个目标序列，加快了以上两种疾病的鉴别诊断[30]。比实时PCR及多重实时PCR更精确的检查方法目前为基质辅助激光脱附/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分析技术，即一种新的蛋白质提取方案，该方法建立在蛋白质谱特征的基础上，是一种快速、经济、准确的分析生物样品的方法[31]，为实验室安全和公共卫生提供了保障，即使布鲁氏菌之间最小的基因组差异，MALDI-TOF-MS分析也可以识别，这使属、种和生物变异鉴定成为可能。Johansen等使用全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)对布鲁氏菌进行准确分型[32]，因为WGS可以对该细菌的整个基因组进行研究，从而提高区分能力,同时可以进行耐药性测试，耐药性的检测能够为更多的抗生素建立断点及制定据药敏选药的指南提供理论依据。结合病史以及在脑脊液中使用以上检测方法有助于对中枢神经型布鲁氏菌病的确诊，但目前国内研究较少。通过病史及以上检测方法再联合肌电图、神经彩超将有助于周围神经型布鲁氏菌病的诊断。

5 治疗

世界卫生组织建议急性布氏菌病患者应选择多西环素(每次100 mg，每d 2次)联合利福平(每次600～900 mg，每d 1次)持续6周口服治疗。由于头孢曲松可自由扩散到体液中[33]，在我国，主要以多西环素和利福平联用为基础，再加用头孢曲松、氨基糖甙类或喹诺酮类其中的一种进行联合治疗，疗程根据病情而定，从6周至4～6个月不等[34]，合并神经系统并发症的患者应加用改善循环及营养神经等药物对症治疗。赵世刚等的研究中得出布鲁氏菌病患者合并复杂颅内感染应给予三联抗生素治疗，并且该治疗应持续到临床表现与脑脊液指标恢复正常，这个过程一般至少6周[5]。Tsevelmaa等研究表明，蒙药即蒙兜铃根提取物联合多西环素等抗生素治疗布鲁氏菌病，可降低高剂量抗生素的毒性，防止抗生素耐药性的发生，预防布鲁氏菌感染[35]。

6 疫苗研究进展及预防

6.1布鲁氏菌病不仅对家畜构成威胁，而且是全球性的公共卫生问题。鉴于布鲁氏菌病及神经型布鲁氏菌病严重的致残性，疫苗的研制迫在眉睫，这降大幅度降低神经型布鲁氏菌病的发生，最新研发的疫苗如下。

沙门氏菌是一种胞内病原菌，其细胞感染机制与布鲁氏菌相似，Mwense等研究发现以伤寒沙门氏菌为基础的联合疫苗对羊布鲁氏菌4种外源抗原(超氧化物歧化酶(SOD)、外膜蛋白19(Omp19)、布鲁氏菌联氨合成酶(BLS)、脯氨酸外消旋酶亚基A(PrpA))在传递免疫原性方面是有效的，接种高剂量疫苗能够有效地控制山羊布鲁氏菌病[36]。另有研究构建了表达流产布鲁氏菌BCSP31、Omp3b和SOD蛋白的活减毒伤寒沙门氏菌株，在小鼠模型中的免疫途径比较发现，SOD蛋白的减毒活疫苗对毒性B.abortus感染表现出最佳的保护作用，并显示此减毒活疫苗可诱导小鼠产生稳定的黏膜和细胞介导的免疫反应。此外，这些结果表明，如果减毒株在人类中被证明是安全的，那么联合表达各种抗原的活减毒伤寒沙门氏菌株，如BCSP31、Omp3b和SOD，可以作为对抗布鲁氏菌病的候选疫苗进行研究[37-38]，从而减少布鲁氏菌对神经系统的损害。

值得注意的是，布鲁氏菌有两种菌落形态，一种形式是光滑的物种，它包含光滑的O-侧链脂多糖(sLPS)。光滑布鲁氏菌包括B.melitensis，B.abortus和B.suis。另一种形态是缺乏O-侧链脂多糖(rLPS)的粗糙种。粗布鲁氏菌包括B.canis和B.ovis。目前，有两种疫苗被批准用于流产B.bovids的动物种群，即sLPS(S19)和rLPS(RB51)。第3种疫苗是rLPS (S45/20)，目前尚未在美国获得许可。然而有一种疫苗sLPS(Rev1)是允许使用的，主要用于小反刍动物中B.melitensis的感染[39]。虽然这些疫苗不能防止布鲁氏菌在动物体内的定植和感染，但它降低了流产事件发生的可能性，打破了传播的循环，保护了兽群中剩余的动物[40]，从而降低人类布鲁氏菌病及神经型布鲁氏菌病的发生。

6.2预防 诊断、治疗/根除和预防是专家经常推荐的黄金法则，为预防神经型布鲁氏菌病，除了疫苗接种以外，首先需要对流行地区的田间农民、田间工作者和当地社区进行适当的健康宣教。如果受感染的动物处于慢性感染状态，应将其宰杀，以防止疾病传播。对实验室用具和实验室工具的定期消毒也会减少临床实验室人员的感染。此外，还需要一项有效的全球政策来彻底根除布鲁氏菌病，须执行适当的兽医立法，并鼓励施行有关动物健康的政策。当患者出现发热、头痛、恶心、呕吐、关节疼痛、肢体麻木瘫痪等症状时应高度考虑神经型布鲁氏菌病的发生。

7 总结与展望

虽然近年来有关神经型布鲁氏菌病的研究报道有所增加，但与其他常见病、多发病的研究相比，其文献量仍存在很大的差距，而神经型布鲁氏菌病危害性大，临床特点复杂多变，慢性布鲁氏菌病临床症状更不明显，随着科学界对布鲁氏菌病越来越感兴趣，我们还需要一种针对布鲁氏菌的广谱疫苗，以便在全世界彻底根除这种疾病[25]。

利益冲突：无