KLF4在肿瘤研究中的进展①

杨 帆 ，冯心河综述， 肖胜军审校

(1.桂林医学院第二附属医院病理科，广西 桂林 541199；2.桂林医学院临床医学院，广西 桂林 541199)

Krüppel样因子 (Krüppel-like factor, KLFs) 得名于果蝇同源基因Krüppel，一般作为转录因子发挥作用。Krüppel-like factor 4(KLF4)是近年来研究较多的锌指转录因子，是人类已鉴定的17个KLFs的成员之一。KLF4又名上皮锌指蛋白EZF(Epithelial Zinc Finger Protein EZF)，因其在胃肠道组织表达较高，也被称为胃肠富集Krüppel样因子(Gut enriched Krüppel like factor, GKLF )。近年来针对KLF4蛋白的研究较多，其作为转录因子在细胞增殖、分化以及凋亡，肿瘤的发生与恶性进展，诱导多能干细胞以及上皮-间质转化等过程中有重要作用。笔者对KLF4的功能进行了综述。

1 KLF4蛋白的结构特点

KLF4基因位于人染色体9q31，长度为5.6 kb，编码的KLF4蛋白长度为513个氨基酸残基。人KLF4蛋白与小鼠KLF4蛋白高度同源。据Uniprot数据库的统计数据(https://www.uniprot.org/uniprot/O43474#function)，小鼠KLF4蛋白长度为483个氨基酸残基，二者羧基端的113个氨基酸完全一致。与KLF家族的其他蛋白一样，KLF4的氨基端高度变异，其125～149位氨基酸残基富含丝氨酸，179～415位富含脯氨酸，其101～109位氨基酸残基为1个9aatad组件，该组件可以抑制靶基因的转录。KLF4羧基端高度保守，包含3个Cys2-His2锌指结构(第430～454、460～484、490～512位氨基酸残基)，每个锌指结构包含1个β折叠和1个α螺旋。KLF4蛋白含有2个核定位信号，第1个位于锌指结构内，另1个位于锌指结构的前方。因此，锌指结构的作用除了可以直接结合DNA之外，还可能与KLF4蛋白的核定位信号有关。

2 KLF4的生物学功能

KLF4在调控细胞增殖、分化、发育、维持正常组织的稳态和凋亡等多种细胞过程中发挥着重要作用[1]。在胚胎发育的过程中，KLF4高表达于胃肠道、皮肤组织[2]，参与皮肤组织的发生、发育与分化成熟[3]。在睾丸组织中，KLF4高表达于支持细胞和减数分裂后的生殖细胞；KLF4在睾丸组织中被敲除后，可导致睾丸发育迟缓、雄配子数减少与精母细胞凋亡增多，说明KLF4在睾丸组织分化及雄性配子成熟过程中有重要作用[4]。KLF4在胸腺细胞和成熟T细胞中高表达，在T细胞被激活后表达下调，表明KLF4在T细胞发育和分化过程中发挥作用[5]。此外，KLF4在角膜、血管内皮等组织均有不同程度的表达[2]。

KLF4常作为转录因子发挥作用，其羧基端的锌指结构可以直接结合DNA，促进或抑制靶基因的转录[2]。KLF4在DNA上的最小结合序列为5′-G/AG/AGGC/TGC/T-3′，该序列存在于许多基因的启动子中，提示KLF4可能参与了这些基因转录的调控。一方面，KLF4可以作为转录因子促进靶基因的转录，比如在T细胞成熟过程中，KLF4与IL-17A的启动子结合，并促进IL-17A的表达；在胸腺的发育过程中，KLF4促进Cdkn1b的转录，促进胸腺细胞增殖[5]。另一方面，KLF4又可以作为抑制因子抑制靶基因的转录，比如KLF4与CYP1A1基因结合序列同其转录激活因子Sp1识别序列重叠，KLF4竞争性抑制Sp1与启动子的结合，从而抑制CYP1A1基因的表达[6]。KLF4作为一个转录因子，关于其促进或是抑制目标基因转录的研究较多，这些研究数据可以充分表明KLF4对基因表达的调控具有双向作用。

通过对相关靶基因的调控，KLF4参与了多种生理及病理生理过程，比如KLF4负性调控细胞的增殖能力。在肠上皮细胞中，KLF4在黏膜绒毛边缘的分化上皮细胞中高表达，这些绒毛细胞已经停止有丝分裂，提示KLF4与生长停止有关[3]。有研究通过微阵列分析KLF4的表达谱，KLF4激活了许多编码细胞周期负调控因子的基因，并抑制促细胞周期基因的表达；此外，对KLF4转录谱的进一步研究揭示，KLF4在调控包括转录、蛋白质和胆固醇生物合成在内的大分子合成基因群的表达方面，对细胞增殖具有整体抑制作用[7]。这些观察表明KLF4是细胞增殖的抑制因子。

但是，KLF4也可以通过抑制凋亡来促进细胞生存。有研究发现，KLF4可以直接抑制TP53和BAX的表达，抑制p53依赖的凋亡通路[8]。另有研究表明，在HDAC抑制剂诱导的半胱氨酸蛋白酶激活后，KLF4通过作用CDKN1C基因抑制SAPK通路，从而抑制细胞凋亡[9]。因此，KLF4在细胞内具体表现出哪种活性取决于其所处的细胞环境，以及与其他生物因子的相互作用。

此外，KLF4还能调节上皮及间质细胞的分化。如前所述，在小肠隐窝中，隐窝底部具有增殖能力的肠干细胞低表达KLF4，但在增殖较弱的绒毛边缘，KLF4高表达，提示KLF4的表达参与了小肠上皮细胞的分化[3]。在皮肤组织中，KLF4在上皮细胞分化调控中有重要作用，KLF4敲除小鼠由于丧失皮肤屏障功能，在出生后不久就因脱水死亡[10]。有研究表明，KLF4的敲除选择性地扰乱了表皮分化晚期的结构，而对表皮已知的结构没有任何形态学上的改变[11]。有研究发现在角膜、晶状体和结膜的表面外胚层结构中敲除KLF4后，可导致角膜脆性增加、基质水肿、晶状体缺损和结膜杯状细胞丢失；此外，该研究者还发现，敲除KLF4后，角膜脆性增加的原因与表皮角质形成细胞的分化障碍有关[12]。这些研究皆表明，KLF4在小肠隐窝、角膜等上皮的分化过程中有重要作用。

除了参与细胞的增殖、分化等过程外，KLF4还参与了细胞DNA的损伤修复。在受放射损伤的小鼠肠道组织内，当DNA轻度损伤时，p53转录激活KLF4，KLF4表达上调，与p53相互作用，激活p21，阻滞细胞周期，利于细胞启动修复程序，修复受损伤的DNA；相反，当DNA损伤不可修复时，KLF4与HuR(RNA结合蛋白)结合减少，KLF4-mRNA稳定性下降，KLF4表达下降，致使p53激活基因BAX，诱导细胞凋亡[13]。

3 KLF4在肿瘤中的作用

在肿瘤发生发展过程中，KLF4既可以成为癌基因，诱导肿瘤的发生与进展，也可以作为抑癌基因，在肿瘤的发生过程中低表达或者缺失。KLF4具体作为癌基因还是抑癌基因发挥作用，与其所处细胞微环境、染色质状态以及其他相关基因的表达情况有关，具体机制目前尚不明确。

有研究发现，在胃癌组织中，KLF4低表达，而在癌旁非癌组织中，KLF4强表达[14]。该研究还发现，在癌与癌旁组织中，KLF4与SP1的表达相互排斥，即SP1高表达于肿瘤组织，低表达于癌旁组织中。KLF4的表达在启动子活性、mRNA和蛋白水平上均抑制了SP1的表达，其可能机制如前所述，KLF4的结合序列和SP1启动子结合位点重叠，KLF4竞争性抑制SP1与启动子的结合，进而抑制SP1的表达[6]。这些结果表明，KLF4在胃肠道癌中发挥肿瘤抑制基因的作用，其表达缺失可能导致肿瘤的发生和进展。另外，除了在胃癌中表现出其抑癌基因的作用，有研究发现KLF4的表达失调与胰腺癌的去分化有关[15]。在肺癌中，大多数原发性肺癌组织中KLF4蛋白和mRNA水平显著降低，KLF4基因敲除促进永生化人支气管上皮细胞生长[16]。该研究通过体外转染，将KLF4基因导入肺癌细胞中，强迫表达，并观察到肿瘤的生长受到抑制。以上数据表明，KLF4在肿瘤发生过程中，作为抑癌基因可抑制肿瘤的发生发展。

尽管KLF4被反复证明是一个抑癌基因，但同样也被证明在许多肿瘤中表现出促进肿瘤恶性行为的能力。有研究发现，在皮肤组织中，基底层角质形成细胞中KLF4的过表达可以导致鳞状上皮异型增生，最终可导致鳞状细胞癌发生；此外，在口腔鳞状细胞癌中，KLF4高表达与淋巴结转移显著相关，KLF4高表达的口腔鳞癌患者5年生存率下降[10]。KLF4在70%的乳腺癌中表达增加，其核表达的增加提示肿瘤具有更好的侵袭性，更容易发生远处转移。有研究通过小鼠移植成瘤实验，证实了KLF4基因敲除可以抑制乳腺癌的发育，提示KLF4在乳腺癌中的表达可以诱导肿瘤发生发展[17]。如前所述，KLF4通常被认为是胰腺癌发展过程中的抑癌因子，但在侵袭性胰腺癌细胞和人胰腺肿瘤组织中，KLF4的亚型KLF4α表达上调，KLF4α可以促进小鼠胰腺肿瘤的生长，其表达与胰腺癌患者生存时间减少有关[18]。以上数据表明，在肿瘤的发生过程中，KLF4也可以作为癌基因发挥作用。

KLF4与其他3个因子(Oct4；Sox2；c-Myc)一起可诱导小鼠成纤维细胞、肝细胞及胃细胞为多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)，也可诱导人体真皮成纤维细胞为iPS细胞。有研究表明，KLF4通过靶向作用hTERT，直接激活正常干细胞和肿瘤干细胞中的端粒酶活性，进而维持细胞的增殖潜能[19]。进一步的研究发现，在激活端粒酶表达的过程中，KLF4主要是通过与β-catenin的相互作用，β-catenin再结合到hTERT的启动子上调控其转录[20]。另有研究表明，KLF4可以激活Nanog的表达，Nanog是一个多能基因，其在干细胞中的表达可以维持干细胞干性特征[21]。此外，KLF4可以通过负性调控内胚层分化基因Gata6和Sox17的表达，阻碍干细胞的分化[22]。以上数据提示KLF4在干细胞干性特征的诱导和维持、促进肿瘤发生之间可能存在潜在关系。

KLF4在上皮-间质转化(Epitehial-to-mesenchymal transition, EMT)的过程中能够激活上皮基因的转录并且抑制间质基因的表达。在肝细胞癌中，外源性KLF4的表达可以抑制其间质的特征，使细胞形态改变为上皮表型，进而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，抑制肿瘤的生长和转移，反之敲除KLF4则增强其间质特性并促进细胞生长与迁移[23]。该研究进一步对机制的研究发现，KLF4可以结合并抑制slug启动子的活性，异位表达的slug可部分逆转KLF4介导的上皮样表型。有研究表明，在乳腺癌中，KLF4通过减少snail(上皮间质化与转移的关键中介)的表达，从而抑制上皮-间质化，进而抑制肿瘤的转移[24]。同样，有研究表明，在前列腺癌中，KLF4是slug表达的转录抑制剂，单纯的KLF4缺失就足以诱导slug依赖的EMT[25]。以上数据表明，KLF4可以在EMT过程起到抑制作用，从而可以降低肿瘤的侵袭、迁移能力，降低肿瘤的恶性能力。

KLF4是一个功能复杂的转录因子，在不同的体内微环境的影响下，它既可以是转录激活因子，也可以作为转录抑制因子，在肿瘤的发生进程中，既可以是原癌基因，也可以是抑癌基因。KLF4在正常细胞、癌细胞、干细胞重编程和上皮-间质转化过程中发挥作用的机制仍不明确，其作为原癌基因和抑癌基因之间转换的分子基础仍有待进一步的研究。