高效液相色谱法分离纯化非达霉素

摘   要： 为了获得高纯度非达霉素样品，以非达霉素粗品为起始原料，基于高效液相色谱法，开发非达霉素的分离纯化工艺，考察不同的流动相、填料和上样量对非达霉素保留与分离的影响，并进行分离条件优化。研究发现：甲酸水/乙腈体系和C8-3填料对非达霉素的保留及杂质的去除情况较好;当上样量为0.8%时，杂质的去除效果良好。优化后，放大到制备水平，以C8-3为固定相，以甲醇为洗脱剂，对非达霉素粗品进行分离纯化，主峰纯度可达99.24%，回收率约为90.74%，样品关键杂质指标均在合格范围内。

关键词： 非达霉素;高效液相色谱;分离纯化;C8-3填料;回收率

中图分类号：O69    文献标识码：A    文章编号：2095-8412 （2020） 06-050-05

工业技术创新 URL： http：//gyjs.cbpt.cnki.net    DOI： 10.14103/j.issn.2095-8412.2020.06.009

引言

非达霉素（fidaxomicin）是由桔橙指孢囊菌发酵产生的一种新型窄谱大环内酯类化学物质[1-4]，分子式为C52H74Cl2O18，结构式如图1所示。非达霉素市场前景广阔，但目前关于非达霉素分离纯化的文献报道相对较少[5-6]。

文献[7]报道了一种分离纯化过程，包括浸提、大孔树脂吸附、萃取、正相柱层析、苯乙烯微球柱、萃取等步驟，但生产周期长，容易造成产品出现降解产物，使纯度和回收率降低。文献[8-10]报道了先采用有机溶剂从微生物菌丝中浸提，再用大孔树脂和制备柱层析进行分离的方法，但是微生物发酵过程十分复杂，而且溶媒浸提会将菌丝中的油脂与非达霉素一并提取出来，这些油脂会吸附到树脂上，使树脂交换容量大大降低，需额外增加工艺步骤去除这些杂质;同时，再生树脂需耗费大量溶剂，生产成本高，不利于大规模生产。因此，研究高纯度非达霉素的分离纯化方法具有重要的意义。

本文以非达霉素粗品为起始原料，采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），通过筛选分离材料和优化洗脱条件，开发一种非达霉素的分离纯化方法。后续仅需简单结晶，即可获得高质量的非达霉素产品。该方法操作简便，获得的样品纯度较高，回收率稳定，适合工业化生产。

1  实验部分

1.1  仪器、试剂与材料

实验所需要的仪器包括S6000液相色谱系统（华谱科仪（北京）科技有限公司）和DAC 50-HB纯化系统（江苏汉邦科技有限公司）。

实验所需要的色谱柱及色谱填料均购于浙江华谱新创科技有限公司。

分析水平所用甲醇和乙腈为色谱纯，购于Sigma-Aldrich公司;磷酸二氢钾、甲酸和甲酸铵为分析级，购于国药集团化学试剂有限公司;水为超纯水。

制备水平所用甲醇为工业级甲醇，水为纯化水。

非达霉素粗品来自浙江野风药业股份有限公司。

1.2 色谱条件

1.2.1 样品分析参数

色谱柱为Unitary C18（4.6 mm×100 mm，3 μm）;流动相A为乙腈，B为50 mM磷酸二氢钾;洗脱条件为等度洗脱，A/B=50/50（V/V）;流速为0.5 mL/min;柱温为15℃;波长为230 nm;进样量为2 μL。

1.2.2 流动相优化考察

色谱柱为C8-1（4.6 mm×250 mm，10 μm）。流动相A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液，C为50 mM甲酸铵（pH～6）水溶液，D为50 mM甲酸铵（pH～3）水溶液。洗脱条件分别为：1）A/B=7/3（V/V）;2）A/C=7/3（V/V）;3）A/D=7/3（V/V）。流速为1 mL/min;波长为230 nm;进样量为1 μL。

1.2.3 填料优化考察

色谱柱分别为C8-1、C8-2、C8-3，色谱柱规格均为4.6 mm×250 mm，粒径均为10 μm。

流动相A为0.1%甲酸水溶液;B为乙腈;洗脱条件为等度洗脱，A/B=53/47（V/V）;流速为0.7 mL/min;波长为230 nm;进样量为100 μL。

1.2.4 上样量考察

色谱柱为C8-3（4.6 mm×250 mm，10 μm）。流动相A为0.1%甲酸水溶液;B为乙腈;洗脱条件为等度洗脱，A/B=53/47（V/V）;流速为0.7 mL/min;波长为230 nm;上样量分别为0.8%、1%。

1.2.5 制备条件

色谱柱为C8-3（50 mm×260 mm，10 m，300 g）;流动相A为0.1%甲酸水溶液;B为乙腈;洗脱条件为等度洗脱，A/B=53/47（V/V）;冲柱条件为A/B=20/80（V/V）;流速为60 mL/min;波长为230 nm;上样量为0.8%

2  结果与讨论

2.1  粗品纯度分析及质量要求

非达霉素粗品经过HPLC检测，如图2所示。主峰（20.35 min）纯度68.66%，关键杂质在18.47 min（相对保留时间RRT=0.91）和18.73 min（RRT=0.92）分别为0.03%和0.08%。根据后续结晶工艺水平，结晶前的粗品要求为RRT=0.91～0.92，杂质之和≤0.15%，其他单个杂质≤0.5%。

2.2  流动相优化考察

对于分离工艺来说，流动相的选择需要考虑样品溶解度、杂质的分离选择性、目标物的峰形以及环保要求等因素。根据非达霉素的溶解特性及环保要求，选择甲醇作为有机洗脱剂，考察了酸水以及不同pH的甲酸铵缓冲盐对分离的影响，结果如图3所示。在pH～6缓冲盐的条件下，非达霉素的保留比较弱，峰形拖尾，杂质的分离度也不高，不利于分离纯化工艺开发。当甲醇比例相同时，非达霉素在酸性条件下保留和分离较好，添加甲酸或者甲酸铵的差异不大。如果采用pH～3缓冲盐的条件，需要在后处理过程中增加脱盐步骤，增加成本，而甲酸为挥发性有机酸，在后处理浓缩过程中基本去除完全，后处理相对比较简单。后续通过继续优化有机溶剂的种类及洗脱条件，最终选择0.1%甲酸水溶液/乙腈（53/47，V/V）体系作为分离纯化的洗脱条件。

2.3  填料优化考察

填料是分离纯化工艺的核心，填料的类型及参数对杂质的分离选择性、峰展宽、上样量、回收率等有很大的影响。实验选取三款填料（C8-1、C8-2、C8-3），采用优化好的分离条件，在大进样量情况下进行模拟制备，并收集目标馏分，检测纯度，计算回收率，结果如表1所示。结果表明，在C8-3填料上，杂质去除效果最好，合格馏分的回收率最高。

2.4  上样量考察

上样量在分离纯化工艺中也是一个关键因素，关系到生产效率和生产成本控制。随着上样量增加，色谱峰变宽，杂质与主峰发生交叉，从而可能影响主峰与杂质的分离度，降低制备样品的纯度[11-12]。因此在放大制备过程中要选择合适的上样量，以便在获取符合质量要求样品的同时保证足够的回收率，从而提高效率，降低成本。

实验考察了不同上样量对产品质量以及回收率的影响，结果如表2所示。当上样量为0.8%时，杂质的去除效果良好，回收率也比较高。当上样量继续增加至1%时，符合质量要求馏分的回收率降低。因此，选择0.8%上样量是比较合适的。

2.5  放大制備

经过上述优化以后，在内径为50 mm的制备柱上进行了放大实验，制备条件如章节1.2.5所述。制备谱图如图4所示。收集53～61 min馏分，检测谱图如图5所示，主峰纯度99.24%，其余杂质符合要求，回收率约90.74%。经过放大验证，该方法的分离效果良好，通过一步结晶得到了高纯度的样品，操作简单，适合工业化生产。

3  结束语

本文基于高效液相色谱法，考察了非达霉素在不同流动相条件下和不同色谱填料上的保留与分离的情况，确定了最大上样量，并放大到制备水平，得到了高纯度的非达霉素样品。

该方法操作简单，分离高效、稳定，所得样品关键杂质指标均在合格范围内，回收率高，适合工业化生产。

参考文献

[1] Parenti F， Beretta G， Berti M， et al. Teichomycins， new antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus Nov. Sp. I. Description of the producer strain， fermentation studies and biological properties[J]. Journal of Antibiotics， 1978， 31（4）： 276-283.

[2] 杨振江， 吴远杰， 张珂， 等. 非达霉素的菌种选育及发酵工艺优化[J]. 中国医药工业杂志， 2016， 47（12）： 1519-1521， 1529.

[3] 姜春梅， 刘洋， 王京晶， 等. 抗感染新药非达霉素的药理作用与临床评价[J]. 中国新药杂志， 2011， 20（23）： 2283-2285.

[4] 马培奇. 美FDA咨询委员会推荐批准非达霉素治疗艰难梭菌感染[J]. 上海医药， 2011， 32（5）： 235.

[5] 高月麒， 李晓露， 王海燕， 等. 树脂吸附法分离纯化非达霉素的研究[J]. 中国抗生素杂志， 2015， 40（3）： 183-185

[6] 王海燕， 李宁， 李晓露， 等. 非达霉素的分离纯化[J]. 中国医药工业杂志， 2015， 46（4）： 351-353.

[7] 胡海峰， 詹阳. 一种从发酵液中分离和纯化非达霉素的工艺： CN104846043A[P]. 2015-08-19.

[8] 唐恒， 杨久林， 孟宪柱， 等. 一种制备高纯度非达霉素的方法： CN104418925A[P]. 2015-03-18.

[9] 任会军， 李道超， 应雪肖， 等. 一种纯化非达霉素的方法： CN104098637A[P]. 2014-10-15.

[10] 路新华， 郑智慧， 丁彦博， 等. 一种游动放线菌菌株及其在制备非达霉素中的应用： CN103320355A[P]. 2013-09-25.

[11] 仲伟潭， 宋盼， 彭亮， 等. 高压液相色谱技术分离制备杆菌肽各组分的研究[J]. 安徽医药， 2018， 22（3）： 422-424.

[12] 潘剑， 陶云国. 胰岛素反相制备色谱的方法开发[J]. 色谱. 2017（8）： 848-854.

作者简介：

周文武（1983—），通信作者，男，浙江温州人，硕士研究生，工程师。研究方向：发酵产物后提取及分离纯化工艺。

E-mail： zhouwenwu1983@126.com

（收稿日期：2020-09-01）