艰难梭菌感染：宿主免疫研究进展

吕 婷， 周芬芬

艰难梭菌（Clostridioides difficile，原为Clostridium difficile）[1]为革兰阳性专性厌氧菌，艰难梭菌感染（CDI）主要通过粪-口途径传播。正常肠道菌群可有效抑制艰难梭菌的繁殖，而抗菌药物、免疫抑制剂等可破坏肠道菌群平衡[2-3]，使其定植并大量繁殖，并分泌毒素A （TcdA，308 kDa，由2 710个氨基酸组成）和/或毒素B（TcdB，270 kDa，由2 366个氨基酸组成）[4]，产生以腹泻为主要表现的一系列临床症候群[5-6]。艰难梭菌是医院感染性腹泻中最常见的病原菌之一。2000年以来，随着高毒力NAP1/BI/027株的出现和传播，医院获得性CDI（HA-CDI）的发病率增长了2.7倍[2-3]。以北美地区为例，HA-CDI所致的死亡率从＜1.5%增长到4.5%～5.7%，在流行期间可以达到16.7%[7-8]。

人体CDI后，机体启动固有免疫应答和适应性免疫应答，前者得到了广泛的研究，包括肠黏膜免疫反应中巨噬细胞的吞噬作用、氧化杀伤作用，以及细胞因子介导的组织损伤和修复作用等；后者一般指T淋巴细胞和B淋巴细胞介导的抗原抗体反应。目前适应性免疫应答研究仍主要关注于艰难梭菌TcdA和TcdB的抗体，包括IgA、IgM和IgG。T淋巴细胞免疫应答的研究并不多。免疫反应与CDI的定植、致病、治疗和预后有着密不可分的关系。本文对CDI后机体出现的固有免疫应答和适应性免疫应答作一综述。

1 固有免疫应答

宿主天然免疫系统在抗CDI过程中发挥着重要的作用。CDI的早期阶段主要是通过诱导固有免疫应答。当艰难梭菌进入人体后，肠道内的天然免疫物质发挥即刻的免疫应答，使肠道内的抗菌肽类物质，如防御素、内源性抗菌肽、溶菌酶等发挥抗菌作用[9]。产生的毒素和定植因子也可诱导机体产生天然免疫应答。

1.1 毒素产生的固有免疫应答

TcdA和TcdB主要由4个结构域组成：①N末端的葡萄糖基转移酶区域（GTD）；②半胱氨酸蛋白酶区域（CPD）；③转运功能区TD（包含疏水区域）；④肽链C端可结合的重复寡肽序列CROP[10]。TcdA和TcdB的GTD结构域可使Rho家族GTP酶（RhoA、Rac1和Cdc42）糖基化，引起肌动蛋白细胞骨架的重新分布和应力纤维的丢失，导致细胞骨架结构改变、细胞变圆、局部粘连解体和紧密连接的丢失[11-12]。TcdA和TcdB引起肠上皮细胞的破坏，使黏膜内免疫细胞暴露，引起免疫反应。

TcdA和TcdB通过激活细胞内的核转录因子-κB（NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）[13]和炎症小体（inflammasome）[14]三种信号途径在肠黏膜上皮细胞和固有层内的单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞启动促炎性反应，释放大量细胞因子，招募以中性粒细胞为主的免疫细胞到炎症部位，清除细菌[15-17]。有研究发现活性氧（reactive oxygen species，ROS）参与TcdA诱导的大鼠肠炎，后来进一步研究发现TcdA可以引起线粒体膜电位的耗竭和ROS的释放，线粒体定位和功能障碍出现在细胞变圆之前，提示TcdA对线粒体的损伤可能发生于细胞毒性的早期[18]。Kim 等[19]也发现受到TcdA感染结肠细胞会产生ROS，进而可以激活p38-MAPK信号通路，导致环氧化酶2（COX-2）的生成和前列腺素E2（PGE2）的分泌，从而上调IL-8基因的转录。在对肠神经细胞的研究中发现，TcdA诱导产生的ROS可降低细胞活性导致细胞凋亡，并且激活p38-MAPK信号通路刺激细胞因子的产生[20]。TcdB可以直接导致线粒体结合还原性辅酶（NADPH）复合体形成，产生的大量ROS直接促进细胞坏死，这一过程是独立于毒素的葡糖基酶作用的[21]。另外TcdA和TcdB可以激活机体的P38-MAPK、ERK1/2途径和接下来的NF-κB途径产生TNF-α、IL-6、IL-23、IL-1β前体和IL-18前体[22]，TcdA通过激活丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径进而激活转录因子AP-1，上调IL-8基因的转录[23]。此外，TcdA和TcdB通过使细胞Rho和Ras家族GTP酶糖基化，可激活胞内感应蛋白吡喃（pyrin）与衔接蛋白ASC、胱天蛋白酶前体（procaspase-1）共同构成的吡喃炎症小体，激活胱天蛋白酶-1（caspase-1），促进IL-18和IL-1β从前体到成熟。活化的胱天蛋白酶-1可以促进IL-1β、IL-18分泌[24-25]。Xu等[25]的研究发现TcdB激活的吡喃炎症小体可以激活胱天蛋白酶-1，进而激活消皮素D（gasdermin D），可引起细胞膜损坏，导致细胞焦亡（pyroptosis）。TcdA和TcdB也可诱导细胞凋亡，毒素可顺序激活胱天蛋白酶-3、8、9，引起人结肠上皮细胞、单核细胞、成纤维细胞凋亡[17]。目前认为细胞凋亡和焦亡是机体抗艰难梭菌侵袭的胞内防御机制。

1.2 定植因子产生的固有免疫应答

研究表明艰难梭菌可以定植在体外的类结肠上皮细胞Caco-2细胞和黏液分泌HT29细胞，可定植在小鼠盲肠、结肠及人的结肠上皮[26-28]。参与艰难梭菌定植的因素包括细胞壁蛋白（cell-wall proteins， CWP）、鞭毛（flagella）等[26，29]。

在C W P中，研究发现S层蛋白（S-l a y e r proteins，SLP）、黏附素66（adhesin Cwp66）以及Cwp84蛋白酶参与了艰难梭菌定植。SLP的前体蛋白SlpA（S-layer precursor）在Cwp84蛋白酶的作用下裂解成高度保守的高分子量SLP（high-molecular-weight SLP，HMW-SLP，也称作P47）和菌株之间高度变异的低分子量SLP（low-molecular-weight SLP，LMW-SLP，也称作P36），而后共同组装成为SLP[30-32]。SLP可以激活巨噬细胞膜上的TLR4信号通路，释放IL-6、IL-10、IL-12p40、巨噬细胞炎症蛋白MIP-1α、MIP-2和单核细胞趋化蛋白（MCP）[33]。HMW-SLP可特异性锚定在人肠黏膜上皮细胞的细胞壁上，而LMW-SLP作为菌体最外层的部分，其高度的序列变异性提示其可能与宿主的免疫反应有关。Lynch等[33]对不同SLP序列的菌株对宿主反应的影响进行了研究，发现含有高度slpA基因变异序列的核糖体核型（ribotype，RT） 027和RT078菌株比RT001和RT014菌株引起更强烈的免疫反应，不仅细胞因子表达升高而且巨噬细胞上的CD40、CD80和MHCⅡ表达也升高。

鞭毛也可介导艰难梭菌对黏膜细胞的黏附并参与黏膜免疫反应。艰难梭菌鞭毛通过激活模式识别受体TLR5，激活NF-κB和MAPK信号途径，促进IL-1β、IL-6、IL-8、IL-22、TNF-α等细胞因子的产生[34-35]。另有研究利用动物实验发现鞭毛和毒素引起的黏膜炎性反应相互协同，鞭毛的敲除会降低小鼠炎性反应的程度[36]。

1.3 固有免疫反应的双重作用

艰难梭菌可通过多种机制刺激机体释放大量促炎因子和趋化因子，招募大量免疫细胞到感染部位，通过以中性粒细胞为主的免疫细胞的吞噬作用，释放抗菌肽、活性氮、ROS清除病原菌[18，37]，同时又产生炎症相关的组织损伤。

CDI可以引起全身细胞因子的级联产生，有些细胞因子对机体起保护作用。研究表明IL-27与IL-27受体结合对CDI小鼠有保护作用[38]。转化生长因子β/核转录因子（TGF-β/SMAD）信号通路保护小鼠免受TcdA导致的损伤[39]。IL-22为双向性细胞因子，在不同组织、不同疾病状态下例如肺、皮肤表现出复杂的生理作用，以肺组织为例，IL- 22在炎症状态下可以促进促炎因子的表达，但在肠道中IL-22表现出对机体的保护作用[40]。体外给予IL-22对CDI小鼠有保护作用。且发现与年轻小鼠相比，老年小鼠存在中性粒细胞的募集障碍，使体内较少表达IL-22，CDI疾病更严重[41]。IL-22与IL-22受体的结合在动物实验中也被证明对小鼠具有保护作用，其发挥作用的机制包括促进上皮组织的再生，下调促炎因子的表达，促进肠道抗菌肽的分泌[42]，并且可以活化肺和肝脏的补体系统，清除易位的细菌等[43]。有研究发现CDI患者和CDI小鼠体内IL-25的表达受到抑制。给予外源性IL-25可以降低CDI相关性死亡率和减轻组织损伤，这一作用是通过肠道嗜酸性细胞介导的[44]。另有研究认为高水平表达的IL-5和 IFN-γ与轻度临床表现和良好预后相关[45]。

某些细胞因子可以介导CDI的致病过程，加重肠道组织的损伤，例如IL-1β、IL-6、IL-8、IL- 16、IL-17A[45-46]、IL-23[47]、巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）和趋化因子CXCL13[48-49]。Huang等[50]发现TcdA和TcdB均可诱导产生血管内皮生长因子（VEGF-A）作用于人肠道微血管上皮细胞，增加结肠血管通透性，有利于TcdA和TcdB的全身性传播。艰难梭菌导致的腹泻患者血清中MIF的水平明显高于非艰难梭菌相关性腹泻患者。同样在小鼠模型中，CDI可增加血清中MIF水平，且清除体内MIF后可明显减轻艰难梭菌诱导的炎性反应和临床表现，降低死亡率。CXCL5 和IL-8 水平增高也可减缓CDI患者病情的康复。此外，IL-8 表达增多与CDI 复发增加相关，再次证明过度的免疫反应会加重CDI病情[51-52]。有研究报道血清IL-2和IL-15的高表达与重症CDI和不良预后有关。

2 适应性免疫应答

产毒艰难梭菌在肠道定植后，患者可出现无症状携带状态。多项研究认为可能与宿主启动针对TcdA和TcdB的体液免疫应答有关。Mulligan等[53]发现无症状携带者血清中的抗体浓度明显高于有症状的CDI患者，尤其是IgA和 IgM。另一研究也证实无CDI症状的住院患者血清中有更高水平的抗TcdA IgG抗体[54]。但也有研究结果与之相反。Johnson等[55]发现CDI患者血清中的抗TcdA IgG抗体更高。适应性免疫应答似乎直接决定艰难梭菌定植后疾病的走向。

2.1 体液免疫

在对CDI患者血清的检测中可以发现抗TcdA和抗TcdB的IgA、IgG和IgM类抗体[56-57]，粪便中可以检测抗TcdA和抗TcdB IgA类抗体。Viscidi等[58]报道在64%患者血清中检测出抗TcdA抗体，66%患者血清中检测出抗TcdB抗体。但多数研究报道抗艰难梭菌毒素抗体的检出率并不高。Bacon等[59]检测了185份血清，IgG-α TcdA阳性率为19.4%，IgG-α TcdB检测阳性率为8.1%。另有研究对健康献血者的400份血浆样本的调查中发现抗TcdA或抗TcdB抗体的阳性率为6%[60]。研究认为黏膜免疫反应针对的是肠毒素TcdA，产生IgA-α TcdA应答。一旦细胞毒素TcdB入血，则可产生全身性IgG-α TcdB免疫应答[60]。目前认为高亲和力的IgA和IgG可以中和毒素，介导对机体的保护[56]，但抗体效价与毒素中和能力并不呈正相关[60]，而IgM通常产生于免疫应答早期，对毒素有着较低的亲和力[61]。血清中抗TcdA和抗TcdB抗体与CDI的复发有关。抗毒素抗体水平越低，越容易复发[62]。Kyne等[63]发现患者初次感染艰难梭菌后，血清中的抗TcdA IgG抗体可减轻复发性CDI的临床症状。

目前多项研究证实针对TcdB的特异性人源性单克隆抗体bezlotoxumab（BEZ）对高危患者复发性CDI预防可取得良好效果[64-65]。bezlotoxumab和actoxumab已经完成三期临床试验MODIFYⅠ和MODIFYⅡ，结果显示单独应用bezlotoxumab可以降低CDI的复发率，单独应用actoxumab时复发性CDI的发生率与安慰剂组并无差异，而联合应用bezlotoxumab和actoxumab可以显著降低复发性CDI的发生率[66]，美国食品药品监督管理局（FDA）于2016年正式通过bezlotoxumab的上市要求，主要用于18岁及以上的患者，发生复发性CDI的高危人群，可降低复发性CDI发生率[67]。

在CDI患者血清中也检测到了针对定植因子的抗体，包括SLP的IgG抗体，Cwp66、蛋白酶Cwp84以及鞭毛蛋白FliC和FliD的抗体[68]。研究发现CDI患者血清中的SlpA抗体高于正常人群。动物实验证实给小鼠和仓鼠直肠注射纯化蛋白SlpA可引起全身性和局部性体液免疫反应，产生IgG和IgA抗体，能减少艰难梭菌在小鼠肠道中定植，并在致死性仓鼠模型中具有部分保护作用[69]。且有研究报道初发艰难梭菌感染患者血清中的抗SlpA IgG抗体水平显著高于复发患者[70]。Cwp66的锚定区N末端和高度可变区C末端均具有免疫原性，Péchiné等[68]在对CDI患者和健康人的血清中均检测到了Cwp66两端的抗体，但C端抗体效价明显高于N端，提示C末端具有更强的免疫原性。也有研究以灌胃、直肠给药、皮下注射Cwp84免疫仓鼠，在仓鼠血清中检测出抗体，并且直肠免疫Cwp84组的艰难梭菌的肠道定植率相比未免疫组降低了26%，仓鼠存活率为33%高于未免疫组[71]。另有研究发现用鞭毛蛋白FliC免疫小鼠可显著降低艰难梭菌的定植，对CDI小鼠的保护可以达到80%[72]。

2.2 细胞免疫

迄今为止，关于CDI的大多数研究还仅局限于抗体和B细胞的研究，对于T细胞在CDI中的作用还知之甚少，但是在对免疫功能受损患者CDI流行病学调查中发现T细胞免疫缺陷患者（HIV感染、实体器官移植后）CDI的发病率和复发率远高于正常人群，以肺移植为例，CDI发病率可高达23%，CDI的复发率在以肺移植为代表的实体器官移植中可高达40%[73]。

T细胞免疫应答与机体的固有免疫应答是互相联系、相互作用的。目前关于适应性免疫应答小鼠方面的研究认为T细胞可以辅助机体B细胞免疫应答和固有免疫应答，CD4+T细胞向B细胞活化提供信号，帮助抗体类别转换、亲和力提高和记忆细胞的形成，验证了抗毒素抗体的产生需要T细胞的辅助[74]。在对固有免疫应答研究中发现，CDI中高表达的IL-1β可作为Th17的分化因子，介导强有力的Th17免疫应答，分泌IL-17作用于CDI的发病过程中[75-76]。有研究报道将Th17细胞接种至小鼠体内，IL-17水平升高，导致艰难梭菌相关性死亡率增加。Th17细胞轴分泌的细胞因子IL-6和IL-23与疾病的严重程度有关。人体感染艰难梭菌后，血清中IL-6水平越高，患者的死亡率越高。因此认为Th17细胞在CDI的致病机制中起着重要的作用。也成为一个潜在的治疗靶点[77]。IFN-γ作为Th1的分化因子，介导的Th1型免疫应答可以保护机体，当Th1型免疫应答向Th2或者是Th17转变时，提示CDI疾病程度加重[45]。从目前的研究报道来看，T细胞免疫也同样存在双重作用。

3 结语

固有免疫应答和体液免疫、细胞免疫彼此相互连接，构成复杂的防御网络应对CDI。本文讨论了艰难梭菌感染宿主后所引起的免疫反应，可以看出目前对CDI的认知不仅仅关注艰难梭菌本身，更应关注艰难梭菌与宿主的相互作用，宿主免疫反应的强弱影响着患者的病情严重程度和预后。对于艰难梭菌与宿主之间相互作用的研究将为新治疗方法和预防措施的研发提供理论基础和研究方向。