肾移植免疫学研究进展

伊特格乐图 综述 陈国俊 审校

青海大学附属医院泌尿外科，青海 西宁 810001

肾脏是人体重要的器官，血液通过肾脏后肾小球的渗透、肾小管和集合管的分泌和重吸收生成尿液；体内代谢产物通过血液运送至肾脏，肾脏重吸收机体所需的营养物质如葡萄糖、氨基酸、蛋白质、电解质离子和水分等，某些废物和毒物排出体外。肾脏不仅具有调节电解质和酸碱平衡的作用，还具有免疫调节功能和内分泌功能如分泌肾素、红细胞生成素、维生素D等。肾脏的主要作用为维持机体内环境的稳定和新陈代谢正常运行。肾脏解剖结构比较特殊，形状像大号扁豆，扁豆凹陷处属于肾门，肾门连接着三个管状结构如肾静脉、肾动脉和输尿管。肾脏微小结构中主要是肾单位，正常成人具有100多万个肾单位，足够保障肾脏血液净化功能。肾脏是腹膜外器官，紧贴于脊柱两侧，腹膜后间隙小，后腹腔镜手术时操作空间较狭窄，手术难度大。肾脏含有甘油激酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，可分解脂肪，再糖异生途径生成葡萄糖，最后进入三羧酸循环被利用。肾脏受多种疾病的影响导致肾脏功能不全，肾功能减退，最终发展成肾脏功能衰竭。导致肾衰竭病因如慢性肾炎、高血压、糖尿病、多囊肾、泌尿系结石、红斑狼疮性肾病、过敏和药物中毒等。近年来我国慢性病发病逐年上升趋势，是主要危害健康的因素；慢性病主要受累器官是肾脏，最终引起尿毒症。据统计2018年我国尿毒症患者在290 万左右并呈逐年上升趋势，目前尿毒症期患者治疗以透析治疗为主。但是透析只能延缓病情，使患者寿命延长10 年左右；透析治疗过程是痛苦的，治疗费用也高，患者生活质量下降。肾移植在终末肾脏治疗中效果显著，优于透析治疗。

1 终末肾脏流行病学研究

肾脏移植是肾脏移植在腹膜后髂窝内、髂静脉与肾静脉吻合、髂动脉与肾脏动脉吻合、输尿管与膀胱黏膜吻合的手术，主要适用于终末期肾脏的替代治疗，慢性肾衰竭到终末期常规治疗无效时适合肾移植[1-2]。据统计，2016 年全球终末期肾脏患者764 万人，肾衰竭主要诱因是糖尿病、高血压等慢性病，亚太地区占比57%，增至435 万人。肾衰竭治疗率较高地区的是北美，治疗率约73.8%，而亚太地区治疗率约28.4%，远远低于北美。在我国慢性肾病发病率为11%左右，随着全球化和中国社会的老龄化，糖尿病、高血压和慢性炎症等慢性疾病发病率同比上升，糖尿病、高血压主要靶器官是肾脏，损伤肾脏功能，导致慢性肾病，慢性肾病最终发展变成尿毒症。我国人口较多，按发病率11%换算，我国慢性肾病患者数量庞大，2017 年慢性肾病患者约为13 300 万人，急需要治疗和干预，这些给社会发展带来重大的负担。终末期肾脏治疗当中肾移植是疗效最好的治疗手段，肾脏来源缺乏是现在移植肾脏治疗的最大障碍。

2 肾移植手术

2.1 移植肾脏的来源 在我国肾脏提供者短缺是限制肾移植的主要原因，最初的亲属关系个体肾脏移植是主要移植肾脏的来源[3]。但是亲属供体和受体之间还存在着血清不相容的问题，是属于血型不相容肾移植(blood group incompatible renal transplantation，BGICRT)。血型不相容性肾移植在国外已开展研究多年，在亲属供体和受体间跨越血型的肾脏移植已经成功开展[4]。

2.2 肾脏移植手术术前准备 术前检测红细胞血型配型和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的配型。HLA 是通过氨基端残基配型标准、淋巴细胞毒交叉实验(complement-dependent lymphocytoxicity，CDC)和群体反应性抗体(panel reactive antibody，PRA)等实验。通过CDC 实验检测淋巴细胞染色率＜10%，PRA＜10%筛查出符合条件肾脏提供者；通过肾脏动态显像明确肾脏功能状态，肾脏血管成像(CT angiography，CTA)明确肾动脉和肾静脉情况，最终评估供者肾脏功能。手术前1 d肾脏提供者静脉补充血容量和白蛋白、肾脏受者血液透析一次，手术前应免疫抑制治疗如手术前1 h 口服吗替麦考酚酯1 g、咪唑立定100 mg免疫抑制治疗。

2.3 肾脏移植手术方法 肾移植传统的手术方式是开放手术，通过髂静脉与肾静脉吻合、髂动脉与肾脏动脉吻合、输尿管与膀胱黏膜吻合方式移植肾脏；现在微创技术的普及，利用腹腔镜微创手术技术肾脏移植；ROSDES 等[5]在世界上首次成功行腹腔镜下肾脏移植手术。腹腔镜下肾脏移植具有创伤小、恢复快、对患者痛苦小和能达到手术预期目的等优势[6-7]。

2.4 肾脏移植手术步骤

2.4.1 游离供者肾脏及血管、输尿管 全身麻醉成功后，常规手术区域消毒，铺无菌单子，在取肾脏同侧腹部穿刺3 个孔，第一个孔在脐平腹直肌旁为气腹使用，第二孔在同侧肋弓下2 cm 处，第三孔在腋中线髂脊上3 cm处。气腹后进腹腔镜，用超声刀切开结肠沟旁侧腹膜，暴露肾脏，首先顺着输尿管在髂血管分叉处游离输尿管，之后在肾门处暴露肾静脉后游离肾静脉，在肾静脉后方游离肾动脉。剥离肾脏取出肾脏，检查无活动性出血后关闭切口。

2.4.2 移植供者肾脏 取出肾脏后在低温条件下修剪肾脏并灌洗肾脏备用，受者全身麻醉成功后，常规手术区域消毒，铺无菌单子，取下腹部腹直肌旁以Gibson 切口，暴露髂静脉和髂动脉；髂静脉与肾静脉吻合，髂动脉与肾脏动脉吻合，输尿管与膀胱黏膜吻合，开放肾脏血循环，查看肾脏颜色，吻合血管有无渗出血，检查手术创口无活动性出血后关闭切口。

3 免疫反应

免疫反应是外源性抗原被巨噬细胞吞噬并溶酶体降解加工，与组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ结合后，表达在细胞表面，激活CD4 T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，成熟B 淋巴细胞分泌抗体，启动体液免疫。内源性蛋白被固有免疫细胞内组织相容性复合物Ⅰ结合后，表达在细胞表面，激活CD8 淋巴细胞，CD8 T 淋巴细胞激活自然杀伤性细胞(natural killer，NK)和分泌穿孔素，启动细胞免疫[8]。

3.1 固有免疫 固有免疫属于非特异性免疫，广泛存在于植物和哺乳动物[9]。HILDEMANN等[10]研究发现无T/B淋巴细胞的盲鳗对预刺激过的移植物产生迟发性过敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)，对移植物产生记忆，增强二次排斥反应，表明非特异性免疫具备记忆性。固有免疫的二次防御是非特异性的，所以固有免疫对于病原体之间存在交叉保护作用[11]。研究 表明卡 介疫 苗(bacillus calemtte-guerin，BCG)不仅防止结核分枝杆菌，而且还能防止白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌[12]。固有免疫的记忆性是非特异的，病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)识别受体(pattern recogniton receptors，PRRs)，以一对多的识别模式[13]。固有免疫细胞的获得性记忆与诱导产生表观遗传重编程(epigenetic reprogramming)的免疫记忆有关，在核酸序列不改变前提下，功能的可逆的可遗传的改变包括核酸序列的甲基化、组蛋白的修饰等[14]。

3.2 获得性免疫 获得性免疫是T/B 淋巴细胞参与免疫应答时的特异性免疫反应，存在于高等脊柱动物。抗原刺激后T淋巴细胞增殖和分化和B淋巴细胞分泌抗体，初始免疫反应分泌IgM 型抗体，再次免疫反应分泌IgG 型抗体，使得其产生免疫记忆，所以获得性免疫二次防御是特异性的、一对一识别的配体与受体识别模式。获得性免疫记忆与编码抗原受体可变区V(variable)、D(diversity)和J(joining)基因片段组合重排有关[15]。

4 免疫耐受

4.1 移植免疫耐受的主要机制 免疫耐受包括中枢和外周免疫耐受，中枢免疫耐受可以通过嵌合体现象、特异性免疫细胞B 淋巴细胞和T 淋巴细胞诱导耐受等方式获得；外周免疫耐受是外周成熟的T 淋巴细胞和B 淋巴细胞缺乏共刺激信号不能产生第二信号、效应T 细胞凋亡、抗原提呈细胞诱导耐受等。

4.2 免疫耐受机理

4.2.1 T 淋巴细胞增殖受阻 T 淋巴细胞活化需要两个信号刺激，T 细胞表面受体(T cell receptor，TCR) CD3 和MHC 分子复合物的结合形成第一刺激信号，抗原特异性；抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)上的配体CD80/CD86 与T 淋巴细胞表面协同刺激分子CD28结合形成第二刺激信号[16]。当只有第一刺激信号作用，而第二刺激信号CD80/CD86-CD28 的缺乏可导致T 淋巴细胞不能有效的激活，免疫细胞无法增殖，导致免疫耐受[17]。所以，T 淋巴细胞激活需要第一刺激信号TCR 和MHC 复合物及第二刺激信号共刺激分子与TCR 分子结合的共同作用下才能完成激活。阻断或缺乏共刺激分子，T 细胞增殖会受阻甚至凋亡[18]。通过阻断第二刺激信号诱导免疫耐受，CD28 和B7 受体配体及CD40 和CD40L受体配体系统成为第二信号通路成员。最近有研究发现调节性T 细胞(T regulatory cell，Treg)可以减少B细胞产生自身抗体，并且Treg细胞在体内和体外均抑制B 细胞的增殖，其机制与B细胞中钙离子通道的减少有关[19]。

4.2.2 T细胞的凋亡 经过阳性选择的自身反应性，T淋巴细胞通过受体TCR与胸腺树突状细胞和巨噬细胞表面的自身抗原肽MHC复合物发生高亲和力结合，发生自身反应性T淋巴细胞程序性死亡，不能结合的自身反应性T 淋巴细胞成熟后进入外周淋巴器官；形成对自身抗原的中枢耐受，成为阴性选择。如果胸腺树突状细胞和巨噬细胞缺陷，无法形成阴性选择，自身反应性T细胞克隆长期存在，出生后会引起自身免疫病。

4.2.3 调节性免疫细胞参与耐受 调节性免疫细胞是促进免疫耐受、有利于器官移植的细胞。包括调节性T细胞(Treg)、调节性B细胞、调节性巨噬细胞、总骨髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cell，MDSC)、粒系MDSC 细胞、单核系MDSC、NK 细胞和浆样树突状细胞(dendritic cell，DC)。Treg是具有免疫抑制作用的CD4 T细胞[20-21]，抑制效应T细胞增殖的负调控免疫应答，特别是CD4+CD25+Treg 是免疫低反应性和免疫抑制作用的T淋巴细胞[22-23]，在自身耐受和移植免疫中发挥重要的作用：(1)Treg细胞与效应CD4+T细胞竞争性结合抗原提呈细胞APC；(2)抑制树突状细胞DC 的抗原提呈功能，从而抑制T 淋巴细胞活化增殖；(3)通过分泌抑制性细胞因子IL-10 使T 淋巴细胞免疫功能失活，维持免疫耐受[24-25]。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，无MHC 限制和不依赖抗体[26]；缺乏受体TCR 和膜结合免疫球蛋白(membrance bound immunoglobulin，Mlg)的淋巴样细胞具有抑制T细胞的免疫反应[27-28]。树突状细胞DC 不仅抗原提呈可诱导免疫耐受[29-30]；未成熟DC 细胞低表达模式识别受体MHC 和共刺激分子CD80/CD86，识别和摄取外源性抗原的能力弱，加工抗原能力弱；这些特征可维持免疫耐受[31]。浆细胞是分泌抗体参与体液免疫应答的主要细胞，是具有B 细胞抗原受体(B cell re-ceptor，BCR)阴性、CD5 阴性表型的细胞，由B2 细胞分化而来[32]。

5 免疫抑制的应用

5.1 供者肾脏在体外预处理 高渗枸橼酸腺嘌呤液(hypertonic citrate adenine，HCA)是临床广泛应用于肾脏移植的保存液，因为HCA 与钙离子形成络合物的特性，钙离子在细胞新陈代谢有重要调节作用[33]。肾脏摘取后，用4℃高渗枸橼酸腺嘌呤液(HCA) 500 mL 内冲洗和浸泡并保存，HCA 保存液借助灌注器与肾动脉插管连接，以1 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)压灌洗离体肾脏，直至肾脏苍白，离体肾脏移植时用4℃的生理盐水通过动脉清洗肾脏内部和肾脏表面。

5.2 移植肾脏的体内免疫干预

5.2.1 血型不相容肾移植 对于血型不相容肾移植(BGICRT)，1955年HUME等[34]首次报道血型不相容性肾移植发生急性排斥反应，直到1987 年ALEXANDRE等[35]通过血浆置换+脾切除手术成功移植血型不相容性移植肾脏。2001 年有研究使用免疫抑制剂利妥昔单抗取代脾切除术效果显著[36]。对于血型不相容性肾移植，肾脏移植手术前1 个月开始使用血浆置换(plasma exchange，PE)+利妥昔单抗预处理，根据受者初始血型抗体效价决定使用方案。移植手术的目标抗体效价是＜1∶16，如果抗体效价高1：16可使用血浆置换，抗体效价低于1∶16可不用血浆置换，而且要求使用利妥昔单抗后CD19+细胞计数变为零。

5.2.2 同种异体肾脏移植 对于同种异体肾脏移植者，使用高效特异性免疫抑制剂及其联合应用能大大地减低移植器官的急性免疫排斥反应。受者术前口服免疫抑制剂三联，如他克莫司+吗替麦考酚酯+泼尼松；免疫抑制剂作用于免疫反应过程中特异性免疫细胞T/B 淋巴细胞增殖分化期和效应期，在增殖分化期联合应用抗嘌呤剂、抗叶酸剂、烷化剂和皮质激素可抑制B淋巴母细胞分化变为浆细胞，进而抑制浆细胞分泌抗体；免疫抑制剂可抑制辅助性T 淋巴细胞增殖分化，进而抑制辅助性T 淋巴细胞提呈B 淋巴细胞；并且抑制T 免疫母细胞分化成为致敏小淋巴细胞。在效应期联合应用抗嘌呤剂、抗叶酸剂、烷化剂和皮质激素可抑制术后免疫排斥引起的炎症反应。

5.2.3 移植术后护理 肾移植术后早期ICU 护理与移植肾脏的功能恢复、术后预后有关，检测和预防并发症的发生以及大量使用免疫抑制剂导致机体免疫功能降低，感染发生的概率明显上升，故预防感染非常重要[37-38]。移植肾脏者出院后应改变不良的生活习惯，少吃多餐、无暴饮暴食，禁烟禁酒等；每个月在门诊行B超检查肾脏血管和血流情况；行CT检查肾脏情况[39]。

6 结语

免疫技术对于肾脏器官移植成功与否具有关键作用，肾脏组织学配型、肾脏的预处理以及移植部位选择可明显减轻移植免疫排斥反应，并且免疫制剂的联合应用有效抑制了急性免疫排斥反应。由于移植肾脏的组织配型难度较大，适合配型成功的较罕见，很难找到相同HLA的个体；使用免疫抑制的并发症导致受者免疫功能低下，对于外界环境抗病能力下降，引起肾脏手术部位的感染，受者变得脆弱，不利于治疗。这些治疗方法对于急性免疫排斥反应控制较理想，但慢性移植排斥还没有很好的控制方法，所以临床应使用新的技术手段解决当前面临的问题。随着基因技术的发展，基因转移技术可应用于移植器官的免疫耐受[40]。

基因转移技术是外源性目的基因或DNA 片段植入与受体细胞或细胞基因当中并且表达在受体细胞或组织中。该技术可用于控制自身免疫抑制分子和天然的免疫系统达成诱导耐受，该种治疗方法应用经过实验室研究到临床试验和临床中使用需要走很长的路，缺乏实验室的数据支持，具体临床治疗方案仍有待进一步研究。