LIM激酶及其抑制剂的研究进展

黄启璐，吴爱兵，杨志雄

广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东 湛江 524000

目前研究发现LIM激酶与许多疾病密切相关，在肿瘤的发生发展中也至关重要，LIMK 不仅与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移密切相关，还促进了肿瘤细胞耐药的发生，因此，针对LIM 激酶的药物研究也成为热点。本文就LIM激酶及其抑制剂做一综述。

1 LIMK的结构及功能

LIMK 激酶是一类存在于真核生物中的丝氨酸/苏氨酸激酶，包括LIMK1 和LIMK2 两个成员，其编码基因分别位于人染色体7q11.23 和人类染色体22q12.2。LIM 激酶具有特殊的结构：具有两个N-末端的LIM结构域、C-末端的激酶结构域以及一个PDZ结构域，其整体序列具有50%的同源性，而激酶结构的序列同源性则高达70%[1-2]。LIM 结构域由一对富含半胱氨酸/组氨酸序列的锌指结构域组成，是LIMK与许多大分子相互作用的结构域，在调节激酶活性中起重要作用。PDZ 结构域包括两个富含亮氨酸的核输出信号，促使LIMK1 优先定位在细胞质中，而缺失PDZ 结构域的LIMK1 突变体则主要定位在细胞核中。C-末端激酶部分包含构成核定位序列的一段碱性残基[3]。虽然LIMK1和LIMK2结构相似，两者表达部位及亚细胞定位存在差异。LIMK1 主要表达于脑组织中，在胚胎和成熟组织以及心脏和骨骼肌中均中等表达，而LIMK2 在所有组织中广泛表达[4-5]。此外，LIMK1 和LIMK2 的亚细胞定位和功能不同，有研究发现LIMK1可与高尔基体膜结合，促进肌动蛋白解聚重组，从而调节高尔基体中蛋白质的运输[6]。

Cofilin 是一种肌动蛋白结合蛋白，其磷酸化与去磷酸化可调节F-actin和G-actin之间的动态平衡，对调节肌动蛋白骨架活性及肌动蛋白相关细胞活动中产生重要作用。目前研究发现，LIMK1 和LIMK2 均可磷酸化ADF/cofilin 的第3 位丝氨酸(ser3)，磷酸化的cofilin丧失活性，与肌动蛋白的结合能力下降，F-actin聚合形成伪足，促进细胞运动；而Ser3 位点的去磷酸化又可恢复cofilin 对肌动蛋白的解聚活性，促进F-actin 解聚为G-actin，参与了肌动蛋白的细胞骨架的重组[7]。LIMK 整合了多种调节肌动蛋白聚合的上游信号通路，通过调控cofilin 的活性从而影响肌动蛋白的稳定性，调控各种细胞的运动、分裂以及各种膜结构和其他的微细结构形成[8-9]，从而对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、细胞周期及凋亡等生物学功能产生重要影响。

LIMK主要受GTPase Rho蛋白家族的调控，Rho、Rac 和Cdc42 蛋白分别通过激活其下游效应激酶ROCK1/2、PAK1/2/4 和MRCKα使LIMK 磷酸化而激活，磷酸化的LIMK 进一步使cofilin Ser3 位点磷酸化从而失活[3]。此外，多种miRNA如miR-20a、miR-210、miR-125a-5p等在癌组织及癌旁组织中的表达有差异性[10-12]，并可影响细胞中LIMK 的表达。miR-138-5p、miR-159d-3p、miR-20a 可通过抑制LIMK1 的表达从而抑制乳腺癌细胞、皮肤鳞状细胞癌细胞的生长和运动能力[13-15]，miR-145 通过靶向PAK4 抑制LIMK1的表达，从而调控结直肠癌细胞的侵袭迁移[16]。

2 LIMK与肿瘤

2.1 LIMK的表达与临床的关系 目前研究发现多种分子如研究发现，LIMK在多种肿瘤如肺癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤鳞状细胞癌等组织中异常表达。SU等[17]使用免疫组化检测了64例正常胃黏膜及140 例胃癌组织中LIMK1 的表达，研究发现，LIMK1 在胃癌组织中呈高表达，并且与肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及预后成正相关。在143例CRC组织中，cofilin、LIMK1、LIMK2、SSH1高表达，与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及分期相关，而化疗失败患者的CRC 组织及耐5-FU 的HT29 细胞中LIMK1、SSH1 表达显著增高，提示LIMK/cofilin 及SSH1 与CRC疾病进展及疗效相关[18]；CHEN等[19]研究发现，在非小细胞肺癌组织中，LIMK1的表达显著高于癌旁组织，并与TMN 分期、淋巴结转移有关，而与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、组织学类型无明显相关性。MARDILOVICH等[20]对前列腺癌组织切片进行染色，发现LIMK1、LIMK2的高表达及其底物cofilin磷酸化的增加与非转移性前列腺癌患者的预后不良和生存期降低具有显著相关性，提示LIMK 的表达及活性与前列腺癌的疾病进展相关。

2.2 LIMK 与肿瘤细胞功能 肌动蛋白具有F-Actin 及G-actin 两种形式，这两种形式的动态平衡参与了肿瘤细胞的多种生物学功能，包括细胞增殖、侵袭、迁移等，LIMK/cofilin通过调节肌动蛋白的重组影响肿瘤细胞的功能。CHEN等[19]通过western blot技术检测了非小细胞肺癌细胞中LIMK1的表达，研究发现在高侵袭性的非小细胞肺癌细胞中LIMK1 的表达高于低侵袭性细胞，利用siRNA 下调801D 细胞中LIMK1的表达后p-cofilin表达下降，细胞的侵袭、迁移能力减弱，提示LIMK1/cofilin通路与肿瘤细胞的侵袭迁移能力相关。LI 等[13]通过双荧光素酶实验发现LIMK1 是miR-138-5p 的靶基因，过表达miR-138-5p可抑制LIMK1/cofilin 的表达可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231、HCC1973 的侵袭迁移，并可将细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制乳腺癌细胞的增殖。抑制卵巢癌细胞中的LIMK1/cofilin 通路也可使卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力减弱[21]。除了LIMK/cofilin 通路，LIMK 还可通过其他途径影响肿瘤细胞的生物学功能。YOU 等[22]使用LIMK-shRNA 转染胃癌SGC7901细胞以下调LIMK1的表达，实验发现，下调LIMK1的表达后，总FAK、paxillin表达无变化，p-FAK、p-paxillin表达降低，胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力下降，提示LIMK1通过调控FAK/paxillin通路调节胃癌细胞的增殖、侵袭迁移能力。

2.3 LIMK与肿瘤耐药性 肿瘤的多药耐药性是肿瘤化疗效果不佳的主要障碍，ZHANG 等[23]发现耐VCR 的骨肉瘤MG63 细胞中LIMK1、p-cofilin 表达较正常MG63细胞高，提示LIMK1可能参与了肿瘤细胞多药耐药的发生。为研究LIMK/cofilin与肿瘤细胞的耐药性之间的关系，陈瑞等[24]利用瞬时转染技术上调骨肉瘤MG63 细胞中LIMK1 的表达，实验发现，随着转染浓度的增加，LIMK1、MDR1 表达增加，长春新碱对骨肉瘤细胞的IC50 值增加，提示LIMK1 表达上调与细胞耐药性增强有关。在非小细胞肺癌中，下调LIMK1可增强非小细胞肺癌801D细胞对顺铂和吉西他滨敏感性[19]，降低顺铂耐药的A549对顺铂的耐药性并诱导细胞凋亡[11]。此外，有一项研究发现LIMK2在耐微管化疗药物的神经母细胞瘤细胞中呈高表达，上调神经母细胞瘤细胞中的LIMK2 可增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，下调LIMK2则可促进异常纺锤体形成，导致细胞分裂异常，提高耐药细胞对长春新碱、长春花碱的敏感性[9]。

2.4 LIMK与肿瘤免疫治疗 肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的机制之一，肿瘤的免疫治疗也是目前的研究热点。THAULAND 等[25]对细胞骨架状态与T 细胞活化之间的联系进行了探索，研究发现原始T 细胞中F-actin含量低较，细胞骨架硬度较高，而效应T细胞则相反。当APCs 提呈的抗原激活原始T细胞后可迅速使p-cofilin 去磷酸化，F-actin 增加，T 细胞骨架硬度降低，免疫突触增大，从而增强T细胞的免疫活性。该研究还发现RohA-Rock-LIMK-cofilin 通路可调节细胞骨架硬度影响T 细胞突触大小，抑制原始T 细胞中的Rock、LIMK可使T细胞免疫突触增大，增强对免疫抗原的免疫反应。这些研究结果提示细胞骨架状态与T 细胞的免疫活性相关，RohA-Rock-LIMK-cofilin信号通路可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点。

3 LIMK抑制剂

由于LIMK/cofilin 通路参与了肿瘤的发生发展，许多学者把它作为一个肿瘤的治疗新靶点，因此一系列的LIMK的抑制剂研究也成为热点。二烯丙基二硫化物(DADS)是大蒜提取物中的主要活性成分，它可以通过抑制ROCK1/PAK1/LIMK1/cofilin 信号通路来减少大肠癌SW480 细胞的迁移和侵袭[26]。噻唑基酰胺衍生物BMS-3 和BMS-5(LIMKi 3)可高度抑制LIMK1 和LIMK2，它们可通过抑制cofilin 磷酸化来抑制小鼠4T1.2 和人MDA-MB-231 乳腺癌细胞的增殖，并减弱U87 和T98G 多形胶质母细胞瘤细胞的生长和侵袭[27-28]；BMS-3 和BMS-5 可促进乙酰化的α-tubulin 表达，诱导微管异常组装，从而抑制A549细胞的增殖[29]。BMS-5 还可通过干预雄激素受体与α-tubulin 之间的相互作用，减少雄激素受体核易位和转录活性从而抑制雄激素受体依赖性前列腺癌细胞的增殖和迁移[30]。MARDILOVICH 等[29]在BMS-5的研究基础上开发了CRT0105446 和CRT0105950，这两种LIMK抑制剂通过减少磷酸化cofilin 的表达而抑制MCF-7 乳腺癌细胞生长以及MDA-MB-231 细胞的侵袭性，此外，横纹肌肉瘤，神经母细胞瘤和肾癌细胞对这两种药物均高度敏感。其他LIMK 抑制剂如Pyr1[31-32]、虎刺醛[33]、葫芦素I[34]和葫芦素E[35]、姜黄素[36]均可通过抑制cofilin 磷酸化从而减弱肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移能力。

除了抗肿瘤作用，LIMK 抑制剂也被应用于其他疾病。FEI等[37]设计合成的LIMK抑制剂R10015是一个小分子典型的I 型ATP 竞争激酶抑制剂，研究中发现R10015 可以通过抑制p-cofilin 从而抑制HIV 以及埃博拉病毒、裂谷热病毒等其他病毒的逆转录、核迁移和释放以及抑制感染的免疫细胞迁移，从而抑制病毒对细胞的感染，表明LIMK 抑制剂可能成为一种新型的广谱抗病毒药物。虽然目前已发现多种LIMK抑制剂，仅有一个LIMK 抑制剂进入了临床试验，即LIMK2 抑制剂LX7101[38]，该药物通过诱导眼小梁网状结构中的肌动蛋白丝解聚使组织松弛，房水流出增加，从而降低眼压，治疗青光眼。

4 结语

随着人们对肿瘤的不断探索，当下肿瘤的诊治水平突飞猛进。目前研究已证实LIMK参与了肿瘤的发生发展，但其对肿瘤细胞生物学功能的影响及调节机制还需要进一步探索。虽然现在已开发出多种LIMK抑制剂，但其相关的临床研究极少，人们还需要进一步行体内外研究实验及临床试验以明确其抗肿瘤的有效性及安全性。总的来说，LIMK 及其潜在的信号通路可能成为抗肿瘤治疗的新靶点。