浅谈高效液相色谱法测定猪肉中磺胺类药物残留的注意事项

魏春梅，熊 杰，李春晓

（1.武陟县畜产品质量安全监测中心，河南 武陟454950；2.攀枝花市动物疫病预防控制中心；3.武陟县动物卫生监督所）

磺胺类药物是一种广谱抗菌药，临床上主要用于预防和治疗感染性疾病，加之其性质稳定，制造不需粮食做原料、产量大、品种多、价格低、使用简便、供应充足等优点，在兽医临床和畜牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物被广泛应用。但是磺胺药物会引起人过敏性反应，且可能有致癌性。随着社会的发展，磺胺类药物的不合理使用，其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，成为人类亟待解决的问题之一，而各类检测方法也随之应运而生。GB/T29694-2013 中规定了用高效液相色谱法测定动物可食性组织中磺胺类残留的检测方法。

高效液相色谱法是在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快等特点。但在县级畜产品质量安全日常监测检测中，常常遇到各种各样的问题。笔者通过测定猪肉中磺胺二甲基嘧啶，阐述一下高效液相色谱法的注意事项。

1 样品前处理

样品的前处理是整个实验的重中之重，而猪肉中磺胺类药物残留的测定较其他试验前处理更是复杂，所以任何一步都可能导致试验的失败。根据笔者做猪肉中磺胺类药物残留的测定遇到的问题与大家分享一下几点：

称好待测样品时，要加入乙腈和无水硫酸钠，因防止结块，所以要立刻涡旋，这样避免样品结块影响样品中磺胺类药物的提取。或者也可以加入乙腈涡旋开后再加入无水硫酸钠，然后再涡旋。

为了提高样品中磺胺类药物的提出率，要两次加入同等的乙腈在涡旋振荡器上振荡提取，所以也要两次离心。为了第2 次的提取效果，第1 次离心要低，一般3 000～5 000 r/min，这样可以避免离心率太高样品不易打散。但第2 次离心率要高，一般在14 000 r/min 以上。

试验前一定事先检查分液漏斗、离心管的密封性，防止在实验过程中漏液，造成试验回收率太低，出现分析上的误差，特别是使用分液漏斗，应做到每次使用前都要检查密封性是否良好。另外收集分液漏斗中的下层液体时，一定要先将上端的玻璃塞拧开，由于压强的原因，避免生拉硬拽将下端打开，造成分液漏斗的损坏。

在减压浓缩过程中要注意压力不要超过0.08 Pa，否则会造成旋蒸液体爆沸。为了在减压旋蒸过程中更好控制压力，可以在链接真空泵的真空皮管处插上1ml 针头，也可以根据压力变化，增减针头数量。旋蒸结束后，一定要先拔掉真空皮管，再取被旋蒸样品，而不是直接关掉真空泵，如果直接关掉真空泵，这样将导致真空泵的水被倒吸到旋蒸样品中。

整个净化步骤包括预洗、上样、淋洗、洗脱四步，需控制碱性氧化铝SPE柱流速3～4 s/滴，洗脱时可控制在1～2 s/滴，切记洗脱时一定控制速度，否则会导致样品添加回收率太低，质控不合格。依次进行预洗、上样、淋洗操作时需在上步液体将近流完时进行，应避免柱床干涸。

用流动相溶解的残留物溶液应该是澄清的，如果仍浑浊可在鸡心瓶里加入正己烷3 ml 涡旋萃取再次脱脂，待分层后取下层液体过滤上机。如果加入正己烷再次脱脂后仍然浑浊，可以把两个微孔滤膜叠加进行过滤，但要注意因为将两个微孔滤膜叠加进行过滤样品，阻力会加大，所以在过滤过程中要把握力度，避免将滤膜冲破或则液体溢出。

2 上机测定

开始操作仪器之前，一定按照顺序进行开机，即打开电源开关—打开电脑—打开仪器各个开关—打开各个模块，待仪器自检通过稳定后，按顺序打开各个模块。首先链接XPG 模块---逆时针拧松清洗阀（两圈半）--点“冲洗”（出现一个对话框提示是否将清洗阀打开，如打开选择忽略）—分别排水—排流动相—排水—排乙腈—排甲醇，拧紧清洗阀。

打开WPS 进行模块链接，分别选择“灌注注射器”、“清洗缓冲环”、“外部清洗针”各点清洗3遍。

根据试验要求，检查是否需要更换色谱柱，如需更换，一定注意流动相流动方向。

如果是新柱，可打开马达，用100%甲醇以0.2 ml/min流速冲洗10～12 h活化色谱柱（为节省时间可以选择过夜冲洗）。如果是旧柱，至少用100%甲醇以0.2 ml/min 流速冲洗30 min，再逐步将流速提升到0.5、1.0、1.2 ml/min，并在每个流速下保持20 min，执行完成后降下流速，换上试验要求的流动相流速平衡系统（在此过程中可以创建仪器方法、处理方法、报告模板、序列等）。打开紫外灯，等灯室温度稳定后，打开采集基线，待基线平稳后可以检查待检样品，测量结束后记得冲洗流路（与平衡系统时相反，同时关闭紫外灯），最后用100%甲醇保护各个流路。断开各个模块的链接，关闭软件，关闭各个模块开关，关闭电脑，最后关闭电源开关，关机顺序不可调换。

3 其他影响因素

3.1 仪器的日常维护

仪器室中一般都会存在一些有毒有害气体，为了加速有毒气体的挥发，可以让排风系统继续工作，禁忌开窗通风，因为长时间开窗可以产生大量的灰尘，影响仪器的精密度和准确度，并且这种污染是很难纠正的。日常维护方法可以将A、B、C、D四个通道都用100%甲醇冲洗，这样就可以将管道浸泡在甲醇中，切记检测器只打开电源，切勿打开紫外灯，因紫外灯寿命有限。维护次数，如果长时间不做试验，可以春秋冬每月1次，夏季由于湿度大，易损坏仪器，可每2个星期1次。

3.2 实验器皿的清洁

高效液相色谱仪是一个精密度非常高的仪器，所以试验过程中使用的器皿一定要保证其清洁度，因为这是取得精确检测结果的前提条件。

3.3 检测过程常见的仪器故障及解决办法

采集基线时，没有基线出现。应该在软件的工具栏上打开“监测基线”对话框，再重新选择所需要的通道即可。

做出的样品峰没有保留时间和峰面积，打印试验报告时会显示。

标准品出现目的峰，而样品中没有出现目标峰，可以通过调整标准品浓度解决，这是因为标准品浓度与待测样品浓度相差太大造成的。添加标准品的浓度原则，尽量选线性范围内较低的浓度（也不能太低，太低易与杂峰混淆，不易辨别）。添加标准品的浓度尽量与单点标准品浓度接近或一致，这样有利于试样的出峰情况与标准品的出峰情况较一致。

如果标准品较标准实验操作规程出峰时间提前，可以提高流动相中水的比例，减少流动相中有机相的比例，如果标准品较标准实验操作规程出峰时间延后，可以降低流动相中水的比例，提高流动相中有机相的比例。

洗针时，审计跟踪显示驱动针上有障碍物，可以暂时在建立“仪器方法”时，选择“Nowash”洗针模式，试验过后要认真检查是何原因造成的。

高效液相色谱仪是一个精密度非常高的仪器，每次试验都会出现不一样的问题，只有多做多积累多交流经验才是应对每一次试验的法宝。