西藏簇角缨象天牛取食诱导核桃树皮和树叶挥发性成分的变化

毛祥忠, 李宗波, 杨 斌, 赵 宁,

(1.西南林业大学云南省高校林木生物技术重点实验室;2.西南林业大学 云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

云南是我国核桃主产大省，截至2017年，全省90%以上的县种植核桃，种植面积已达288万hm2，产值高达330亿元[1].西藏簇角缨象天牛(Caciacretiferathibetana)隶属于鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)缨象天牛属(Cacia)，是危害云南核桃的主要蛀干害虫之一.该虫在4月底以成虫蛀孔羽化、迁飞，5月产卵，6月底幼虫开始蛀入树干，当年以幼虫越冬，直至羽化为成虫，成虫在树干内生活至蛀孔迁飞[2-3].成虫会在核桃树皮上刻槽，槽间为1～2 cm，从下至上呈“︱”形，槽刻至核桃树的韧皮部；幼虫啃食的部位主要是寄主的韧皮部，之后进入树木的木质部钻蛀为害，从虫孔排出大量粪便和木屑[4].受害的树木因营养器官被破坏导致水分丧失，被害部位皮层开裂，甚至形成极大的树瘤，最后树木逐渐干枯死亡，遇风容易折断[5-6].

植物在正常的生理状态下，能够合成并释放一系列挥发性小分子有机物，这些小分子物质对植食性昆虫的取食、产卵、求偶等行为具有调控作用[7]；同时，昆虫通过依靠其嗅觉感器识别植物挥发性小分子物质来筛选合适的寄主繁衍后代[8].植物受到植食性昆虫的攻击后，释放的挥发性物质种类和含量会发生变化[9-10]，还会伴随一些防御性次生代谢产物的释放，其中萜烯类化合物是最丰富的一类.研究表明，虫害诱导的挥发性萜类化合物的种类和相对含量都比健康植物合成的挥发性萜类多[11-13].卓志航等[14]研究表明，云斑天牛(Batoceralineolata)寄主核桃树皮及树叶释放的挥发性成分中萜烯类相对含量最高；王佩星[15]研究发现，被光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)危害的山核桃释放的挥发物中罗勒烯含量与健康山核桃相比显著提高；马艳等[16]研究发现，经桑天牛(Aprionagermari)取食和产卵危害后，山核桃释放的挥发物主要是萜烯类化合物，其中(E)-β-罗勒烯和罗勒烯含量显著上升.但是，有关西藏簇角缨象天牛取食后核桃树皮和树叶挥发性成分的变化尚未见报道.为此，本研究对西藏簇角缨象天牛取食前后核桃树皮和树叶中的挥发性成分进行测定，以期为深入研究西藏簇角缨象天牛与寄主之间的相互作用以及研发其高效引诱剂奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

样品于2018年5月采自云南省大理州弥渡县核桃林.在三台核桃(Juglanssigillata‘San-tai’)林中随机选取3株西藏簇角缨象天牛取食过3 d的核桃树进行采样，同时选取3株树龄相同的健康核桃树作为对照.选取距离地面2 m的核桃枝干，用剪刀剪下后采集树皮和树叶，置于冰盒中带回实验室处理.每个样品设3个重复.

1.2 核桃树皮、树叶挥发性物质的提取

采用同步蒸馏萃取仪提取核桃树皮和树叶挥发性物质[17].取新鲜健康的和取食后的树皮、树叶各100 g，剪碎后分别放到2 000 mL圆底烧瓶中，加入400 mL蒸馏水蒸馏4 h，用20 mL色谱纯正己烷进行同步萃取.然后在正己烷萃取液中加入干燥的无水硫酸钠脱水，用N2吹扫法对萃取液进行浓缩.

1.3 气质联用仪(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)测试

色谱柱：HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样量2.0 μL，无分流进样.升温程序：柱温60 ℃保留2 min，以4 ℃·min-1升到100 ℃，保持5 min，以10 ℃·min-1升到260 ℃，保持5 min.电离方式为EI源，离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；质量扫描范围40～500 amu.

挥发物成分鉴定通过标准化合物比对以及NISTD2质谱库出峰时间和质谱图进行匹对，通过面积归一化法测定各种挥发性化合物的相对含量[18].

2 结果与分析

2.1 树皮挥发性物质主要成分及相对含量

采用GC-MS对核桃树皮挥发性物质进行分离测定，从健康核桃树皮中共鉴定出含量大于0.1%的化合物9类35种(表1)，相对含量较高的成分依次为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚(16.70%)、1-石竹烯(8.93%)、邻苯二甲酸二异丁酯(7.36%)、β-蒎烯(6.89%).按照有机化合物的种类分析，相对含量最高的是萜烯类化合物(39.63%)，芳香族化合物(18.78%)次之.从西藏簇角缨象天牛取食过的树皮中共鉴定出含量大于0.1%的化合物9类39种(表1)，相对含量较高的成分为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚(16.82%)、1-石竹烯(11.49%)、β-蒎烯(11.22%)、3-(2-羟基-6-苯甲基)-4-喹唑啉酮(6.90%).按有机化合物的种类分析，相对含量最高的是萜烯类化合物，达55.50%；芳香族化合物次之，含量为17.89%.与健康核桃树皮相比，萜烯类化合物相对含量升高了15.87%.

从表1可见，健康核桃树皮挥发物中有8种化合物在受害树皮中未检测到，分别为左旋-α-蒎烯、3-甲基-3-乙基戊烷、α-古芸烯、19-杜松醇、β-人参烯、2-氨基-6-三叔丁基-4,5,6,7-四氢化-1-苯并噻吩-3-甲酰胺、1-甲酰基-2,2-二甲基-3-E-(3-甲基-丁-2-烯基)-6-甲烯基环己烷和异吲哚(1,2-b)喹啉酮；而受害树皮挥发物中有12种化合物在健康核桃树皮中未能检测到，分别为(1R)-2,6,6-三甲基二环[3.3.1]庚-2-烯、双戊烯、松油醇、氧化环己烯、a-荜澄茄油萜、α-石竹烯、1,6-环癸二烯、二十四烷、氧化石竹烯、α-长叶蒎烯、α-桉叶油醇、十九烷.

表1 健康与受害核桃树皮的挥发性成分比较Table 1 Comparison on the volatile components in healthy and damaged walnut bark

此外，受害树皮挥发物中有8种化合物含量较健康树皮明显降低(表1)，分别为2,2-二甲基四氢呋喃、邻甲氧基苯酚、β-荜澄茄油烯、1-对甲苯基-2-咪唑烷酮、异丁香烯、β-桉叶醇、邻苯二甲酸二异丁酯、二十烷；含量较健康树皮明显升高的有6种，分别为β-蒎烯、1-石竹烯、α-蒎烯、1,3-环癸二烯、3-(2-羟基-6-苯甲基)-4-喹唑啉酮、二十五烷.可见，西藏簇角缨象天牛取食后，核桃树皮挥发物中含量变化最大是萜烯类化合物.

2.2 树叶挥发性物质主要成分及相对含量

核桃树叶提取物的GC-MS分析结果(相对含量大于0.1%)见表2.其中，健康树叶共鉴定出8类35种挥发性物质，主要成分为左旋-β-蒎烯(12.63%)、(1R)-2,6,6-三甲基二环[3.3.1]庚-2-烯(9.19%)、1,6-环癸二烯(7.62%)、5-丁香酸(6.16%)；相对含量最高的是萜烯类化合物，达54.77%.西藏簇角缨象天牛取食后的树叶中共鉴定出7类35种挥发性物质，主要成分为1-石竹烯(14.35%)、β-蒎烯(12.70%)、左旋-α-蒎烯(11.64%)、1,6-环癸二烯(11.36%)、5-丁香酸(8.86%)、d-杜松烯(6.60%)、1,6,10-十二碳烯(6.45%)；相对含量最高的是萜烯类化合物，达75.74%，与健康核桃树叶相比，萜烯类化合物相对含量升高了20.97%.

表2 健康与受害核桃树叶的挥发性成分比较Table 2 Comparison on the volatile components in healthy and damaged walnut leaves

续表2

保留时间min登录号化合物名称化学式相对含量/%受害树叶健康树叶42.78001139-30-6氧化石竹烯C15H24O3.422.5242.85021747-46-6绿花烯C15H241.1643.54006813-21-4桉叶-3,7(11)-二烯C15H241.191.0443.73000473-15-4β-桉叶醇C15H26O1.192.5646.55000118-58-1柳酸苄酯C14H12O30.180.1450.03003422-02-4氨基甲酸C14H13NO20.1651.98000150-86-7叶绿醇C20H40O0.110.12

健康核桃树叶挥发物中有7种化合物在受害树叶中未检测到，分别为2-乙基呋喃、(1R)-2,6,6-三甲基二环[3.3.1]庚-2-烯、左旋-β-蒎烯、2,6,6-三甲基-1-环己烯基乙醛、β-荜澄茄油烯、(E)-β-金合欢烯、β-杜松烯；而受害树叶中也有7种挥发性化合物在健康核桃树叶中未能检测到，分别为左旋-α-蒎烯、β-蒎烯、右旋萜二烯、1,6,10-十二碳烯、d-杜松烯、绿花烯、氨基甲酸.

与健康核桃树叶相比，受害树叶挥发物中有6种化合物含量明显降低，分别为反式-2-己烯醛、桉叶油醇、水杨酸甲酯、α-蒎烯、(1z,4z,7z)1,5,9,9-四甲基-1,4,7-环十一三烯、β-桉叶醇；含量明显升高的有5种，分别为α-荜澄茄油萜、1-石竹烯、5-丁香酸、1,6-环癸二烯、氧化石竹烯.可见，西藏簇角缨象天牛取食后，核桃树叶中挥发物相对含量变化最大的是萜烯类化合物.

3 讨论

现有的研究表明，植食性昆虫取食会诱导植物代谢的挥发性物质发生变化[19-21].本研究采用同步蒸馏萃取结合GC-MS，对健康的和西藏簇角缨象天牛取食过的核桃树皮、树叶挥发性成分进行了测定，发现核桃树被西藏簇角缨象天牛取食后，树皮、树叶的挥发性成分及其相对含量均发生了变化，其中变化最大的萜烯类化合物，树皮中含量升高了15.87%，树叶中的含量升高了20.97%.已有研究表明，植株经植食性昆虫取食诱导释放的萜烯类化合物种类和含量都明显高于机械损伤或健康植株[22]，这与本研究结果一致.萜烯类化合物是虫害诱导的植物挥发性次生物质的主要成分，大多数是植物受害虫侵害后脂质代谢的产物，在植物防御中起着直接和间接的作用[23-26].

西藏簇角缨象天牛的取食还诱导核桃树皮、树叶产生了新的挥发性化合物，如松油醇、α-桉叶油醇等;同时，受害树皮和树叶挥发物中部分化合物组成与健康核桃树皮、树叶相同，但含量发生了显著变化，如β-桉叶醇、1-石竹烯等.这些挥发性化合物是否会影响西藏簇角缨象天牛的寄主定位和选择行为，需要进一步验证.