观赏植物铜钱草的组织快繁技术研究

唐凝，李旭东，裴冬丽

(商丘师范学院 生物与食品学院，植物与微生物互作河南省高校重点实验室，河南 商丘，476000)

0 引 言

铜钱草(Hydrocotylevulgaris)又名香菇草，是伞形科天胡荽属多年生草本植物，原产欧洲、北美及美洲中部地区[1].铜钱草叶片呈翠绿，外形如铜钱，小巧玲珑，具有适应性强，生长旺盛的特点.铜钱草生长环境湿润，对其周围水源有去除氮、磷和有机物的功能，可以起到净化城市污水的作用[2]；作为室内观赏植物，铜钱草能够吸收甲醇等有害气体，净化室内环境[3].随着近年来大量外国观赏植物被引入国内，铜钱草逐渐受到消费者的喜爱，成为热门的水生观赏植物，同时也广泛应用于园林绿化及湿地造景[4].

观赏植物组织培养就是在无菌操作条件下，分离观赏植物体的花、茎尖、茎段、叶片或幼胚等部位，并配合营养物质与生长调节物质，通过人工模拟生长环境，控制温度、光照等因素，使其迅速繁殖，短期内选育出大量遗传性状统一的幼苗，又称植物克隆育苗技术[5].植物克隆育苗技术培育优质组培苗，可作为提高铜钱草人工种植效率、培育新品种、选育更优性状的重要技术手段.通过诱导叶片愈伤组织增殖，经诱导分化、壮苗生根后能够培育出大量优质的铜钱草苗.本试验通过优化组培快繁方法，提高分化效率，建立高效的铜钱草离体再生培育体系，为优质铜钱草苗的培育提供理论依据和应用价值.

1 材料与方法

1.1 材料

生长良好，无病虫毒害的铜钱草植株购自商丘市花卉市场.移栽至实验室光照培养箱培养一周后，采用其叶作为外植体.

1.2 培养基及培养条件

以每1000 ml MS培养基(Murashige and Skoog)加入7 g琼脂、30 g蔗糖，作为基础培养基.每1000 ml 1/2MS培养基加入7 g琼脂、15 g蔗糖，作为1/2MS基础培养基，pH调整为5.8.光照培养室温度25 ℃；诱导愈伤和继代培养为暗培养；分化和生根诱导时，给予每天12 h光照(光强1200 lx)[6].

1.3 消毒处理

分别以0.1%氯化汞和2%次氯酸钠进行外植体消毒试验.将健康的铜钱草叶片，在流水中冲洗20 min，转入超净工作台，75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗5次，用0.1%氯化汞或2%次氯酸钠消毒6 min、8 min、10 min或12 min，最后用无菌水冲洗叶片4次，置于灭菌滤纸上，吸干表面水分.将消毒后的叶片用有弧度的刀片切去边缘部分，成1 cm×1 cm正方形.接种至MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养基，10 d后观察统计外植体的污染情况，20 d后观察不同处理的外植体的愈伤组织诱导情况，并进行数据统计，选出最适消毒方式.

1.4 不同激素配比对愈伤组织诱导分化的影响

基础培养基MS，添加不同浓度的6-BA、NAA生长调节剂，6-BA质量浓度设为0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L 3个水平，NAA质量浓度设为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L 3个水平，共9种组合方法.各个组合接种9瓶，每瓶接种3个叶片为外植体.20 d后察看并记录下外植体愈伤组织生长情况.45-50 d之后观察不定芽分化，并统计数据.

1.5 生根培养

不定芽生长到1-2 cm时，将其转接到以基本培养基MS，添加NAA、IBA不同质量浓度的诱导生根培养基内，NAA浓度均为0.1 mg/L，IBA浓度为0 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L，共5种组合方法，25 d后观察并记录其生根情况，计算不同组合下不定芽生根率和平均生根长度.

2 结果与分析

2.1 不同消毒试剂及消毒时间对外植体消毒的影响

采用不同时间的0.1%氯化汞或2%次氯酸钠进行外植体消毒处理，研究不同消毒条件对外植体成活的影响.消毒试剂浓度过高或消毒时间过长会导致外植体褐化死亡；消毒时间过短或消毒不彻底则会引发外植体的大量污染.本试验不同灭菌处理对外植体的影响结果见表1，采用0.1%氯化汞作为消毒试剂时，消毒10 min的外植体污染率最低4%，消毒8 min的外植体成活率最高62%；采用次氯酸钠作为消毒试剂时，处理10 min，外植体的污染率最低6%，出愈率最高86%.综合分析不同处理组的消毒效果，使用2%次氯酸钠处理10 min，75%酒精处理30 s的消毒方法，外植体污染率最低，出愈率最高，为最适消毒方法.

表1 不同灭菌处理对外植体的影响

2.2 不同激素配比对铜钱草叶片愈伤组织诱导分化的影响

以叶片作为外植体，本试验研究了用不同激素(6-BA与NAA)浓度组合进行愈伤组织诱导分化培养，得到以下数据(表2).在20 d时观察的愈伤组织成长状态(图1A)，比较其出愈率，其中培养基9的出愈率最高.待45 d之后观察到培养基2、3、9中有较多的的愈伤组织分化出不定芽，茎延伸生长(图1B).9号培养基的分化率最高，达到95.06%.2号培养基虽然出愈率高，但其分化率很低.8号培养基的生长情况与2号类似.1号、7号培养基只有少量外植体诱导形成不定芽，且不定芽的长势较弱.4号培养基的出愈率和分化率都很低.比较出愈率和分化率，选择最适的诱导分化培养基为9号培养基，即MS+6-BA1.5 mg/L+NAA1.0 mg/L.

图1 铜钱草组培苗的培养及扩繁A：胚性愈伤组织；B：不定芽；C、D：生根培养Figure1 Culture and multiplication of Hydrocotyle vulgarisA: Embryonic callus multiplication;B: Bud seedlings;C,D: Roots development

表2 不同植物生长调节剂配比对愈伤组织诱导分化的影响

2.3 不同激素配比对铜钱草苗根系生长的影响

用0.1 mg/L NAA与不同浓度的IBA的1/2MS培养基进行不定根诱导，探究不同浓度生长素IBA对诱导不定根的影响.不定芽接至生根培养基，25 d统计不定根数目，测量不定根长度，计算生根率与平均根长，图1C、1D为诱导生根培养.结果见表3，采用加入0.05 mg/L IBA的1/2MS培养基生根率最高，为96.30%，平均根长2.30 cm；0.10 mg/L IBA的1/2MS培养基生根率91.36%，平均根长为2.47 cm.综合分析，平均根长接近，生根率接近的情况下，生根率高且所需激素量越小的组合生产效率更高，因此，0.1 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA的1/2MS为最佳生根培养基.

表3 不同植物生长调节剂配比对生根的影响

2.4 炼苗和移栽

组培条件为无菌高营养环境，组培苗抗逆性差，根系活力低，直接移入土壤中成活率低.为增加成活率，待苗高度为3-4 cm时，需要将组培瓶口打开炼苗1周，之后将组培苗取出，在自来水下小心冲洗除去根部的培养基，移栽至珍珠岩∶草炭∶蛭石为1∶1∶1的基质中.每4 d浇灌一次1/3MS营养液，24 ℃光照培养室培养，定期浇水，保持土壤湿润[7-8].植株移苗后涨势良好，出现新芽.

3 讨 论

组织培养已广泛应用于观赏植物的幼苗培养、品种选育、标准化生产等环节，相较于有性繁殖，组织培养铜钱草苗能够增加产量、提高效率、优化性状，但铜钱草的组织培养方法报道少，且培养效率不高[9].众所周知在标准化生产组培苗的过程中，外植体消毒成功率直接影响组培苗的产量.黎海利等[10]在组织培养报春花科聚花过路黄植物时，选用氯化汞浸泡6 min的方法对外植体进行消毒处理，但消毒效率不高.本试验为提高铜钱草外植体消毒成功率，探究了不同试剂与不同处理时间对外植体消毒效果的影响.本试验采用2%次氯酸钠消毒处理10 min的方法使外植体成活率达到86%，值得注意的是次氯酸钠安全性明显优于氯化汞，毒害性小.杨洪元等[11]认为MS基础培养基中加入1.5 mg/L 6-BA+0.18 mg/L NAA可作为广金钱草的继代培养基，可诱愈伤组织，但形成的愈伤组织形状不规则，易褐化.为实现铜钱草的高效增殖扩繁，本试验用不同浓度6-BA和NAA组合的MS培养基进行愈伤组织诱导和分化培养、不同浓度NAA和IBA组合的1/2MS培养基进行生根培养，得到一组分化率达95.06%，生根率达96.30%的铜钱草快速扩繁体系.组织培养的铜钱草苗具脱病毒、增殖倍数大、繁殖材料少、苗株大小一致等优点.本试验成功建立了高效的铜钱草组培体系，对标准化、规模化生产优质铜钱草苗、提升培育质量提供了理论依据和实用价值.