利用陶瓷膜技术精制丹酚酸B及其降糖活性的研究

钱 凯，何 潇，宋丹丹，谭 婷，冯育林,，杨世林，温 泉 *

1江西中医药大学 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；2创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室，南昌 330006

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge.的干燥根及根茎，主要功效为活血化瘀，在中医临床上有数千年的历史，主要成分为脂溶性[1]和水溶性酚酸类成分，丹参总酚酸为其主要活性成分群[2]，包括丹参素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B等，其中以丹酚酸B含量最高，为丹参总酚酸的主要药效成分[3]。目前已有多种以丹参总酚酸为主的制剂如丹参多酚酸盐注射液、丹参滴丸等。而丹参多酚酸的工艺制备决定其药效和成本，现今主要采用多步醇沉方法和30%乙醇直接提取法制备丹参总酚酸，但丹参总酚酸的损失量多达到30%～50%，且乙醇消耗大，存在溶剂残留风险。另外，大孔树脂吸附法[4]用于除去非药效大分子物质如蛋白、鞣制、色素等。以上几种方法或可达到不同程度的精制效果,但都存在丹参多酚酸的损失、大分子杂质残留等精制程度不高等共性问题。因此，急需一种快速、高效、经济的方法富集精制丹参总酚酸类，不仅可以节能降耗，同时满足精制丹酚酸B单体的原料供应。

陶瓷膜因具有耐高温、酸、碱、且强度高等优异的材料性能,在中药提取纯化行业具有普遍的适用性[5,6]，在许多提取分离富集方面展现其优越的性能[7]，而且易于清洗，节能降耗。如徐南平等将陶瓷膜技术引入中药口服液的生产，有效地除去了药液中的大分子、鞣质及其他非药用物质，提高了药液有效成分的相对含量，使得产品的收率和品质得到了显著的提高[8]，并且易克传等研究发现陶瓷膜精制总黄酮效果优于传统富集方法[9]，Guo等[10]研究发现陶瓷膜技术可有效减轻中药水提液对树脂的毒化作用，提高中药精制效果。

基于陶瓷膜的优越性能，本研究考察了水提醇沉法、30%乙醇直接提取法和陶瓷膜法精制丹参水提液中丹参总酚酸的产率以及丹酚酸B的含量，进一步确定了陶瓷膜精制丹参总酚酸的最佳膜孔径、温度、压力等条件，以及从总酚酸中纯化主要药效成分丹酚酸B的方法，在丹参总酚酸制备及丹酚酸B单体工艺上具有一定的经济和应用价值。此外，有研究发现丹参及其复方制剂具有显著的降糖活性[11]，但是在细胞水平上未见对丹酚酸B单体的研究，为此，本研究还进一步采用HepG2细胞对其降糖活性进行了研究，以期从提取、纯化制备及药理活性，节能降耗方向研究开发丹酚酸B作为降糖候选物质。

1 材料与方法

DHG- 9036A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；岛津分析型HPLC(Nexera XR系列)；陶瓷膜分离装置(江苏久吾高科，南京工业大学膜科学技术研究所研制，配备500、200、50 nm孔径的膜)；旋转蒸发仪(EYELA，东京理化)；Thermo多功能酶标仪(美国)，YZN- 50型液体真空浓缩煎药机(北京东华医疗设备公司)；岛津UV- 2201紫外可见分光光度计；赛托里斯分析天平AL- 104；大孔吸附树脂HP20(日本三菱公司)；20 kg丹参饮片购买于安徽亳州，批号为18091209；丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111562- 200605)。

1.1 提取工艺

水提醇沉法(WM)制备丹参总酚酸：称取丹参2.0 kg，用20倍加热回流水提2次，合并提取液，浓缩至适宜体积，加入1倍无水乙醇，离心得沉淀(含总酚酸)，真空干燥至恒重，称重，得率(%)= 总固体物/2 000 g，即为丹参总酚酸得率。

30%乙醇提取法(EM)制备丹参总酚酸：称取丹参2.0 kg，用20倍的30%乙醇回流提取2次，合并滤液，减压蒸干至恒重，称重，得率(%)= 总固体物/2 000 g。

陶瓷膜(CM)技术制备丹参总酚酸：称取丹参2.0 kg，用20倍的水回流提取2次，约80 L，选用500 nm孔径陶瓷膜进行超滤，控制压差为0.2 Mpa，流速控制约为2 L/min，将超滤液蒸干至恒重，称重得率(%)= 总固体物/2 000 g。

1.2 含量测定

总酚酸含量测定：对三种提取方法所得的总固体物进行总酚酸含量的测定，总酚酸含量测定采用比色法[4]

液相条件：岛津分析型HPLC(Nexera XR系列)、Cromasil (180 mm×5 μm,i.d.2.5 μm) 液相色谱柱梯度洗脱(10%～90%甲醇- 水，40 min)，柱温30 ℃。

1.3 HepG2 细胞培养及胰岛素抵抗模型建立

细胞培养及模型建立参照文献[11]，按组别培养细胞后，收集细胞到15 mL离心管内，离心后弃上清，加入蒸馏水体积400 μL，超声波破碎细胞(冰浴，功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次)，置恒温金属浴中煮沸10 min(盖紧，防止水分散失)，冷却后，8 000 g，25 ℃离心10 min，取上清液备用。实验中通过葡萄糖氧化酶法检测细胞葡萄糖含量来计算HepG2细胞对葡萄糖的摄取情况。葡萄糖含量按照蛋白浓度计算。

葡萄糖含量(μmol/mg)=C ×(A测定管-A空白管)

÷(A标准管-A空白管)×V样÷(Cpr×V样)=(A测定管-

A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

C：葡萄糖溶液浓度，1.0 μmol/mL；V样：加入的样品体积，50 μL = 0.05 mL；Cpr：样品蛋白浓度mg/mL，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

1.4 丹酚酸B对HepG2细胞的毒性试验

将HepG2细胞5×103cell/well的细胞密度，每孔100 μL，接种到96孔板，培养24 h；加入100 μL配制好的丹酚酸B溶液，分别设置6个浓度(终浓度为250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 μg/mL)，每个浓度6个复孔，同时设置对照组以及空白组，培养24 h；每个孔加入50 μL的5 mg/mL的MTT，继续培养4 h；将96孔板的培养液移除，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡溶解后，用酶标仪在490 nm下检测吸光度。

细胞存活率的计算公式如下：

其中Absample为检测样品的吸光度；Abnormal为正常对照组的吸光度；Abblank为空白组的吸光度。

1.5 丹酚酸B对HepG2胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖含量的影响

实验共设置四组，正常对照组中只有细胞；模型组中只有HepG2胰岛素抵抗细胞；阳性药组中不仅有HepG2胰岛素抵抗细胞，还有0.1 mg/mL的盐酸二甲双胍；给药组为丹酚酸B，浓度设置为高、中、低3个浓度，分别为30、15、7.5 μg/mL。其检测方法为造模完成后，给药，12小时后，通过葡萄糖含量检测试剂盒来计算细胞的葡萄糖含量。

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对总固体物及总酚酸含量的影响

图1 三种提取方式总固体物、总酚酸量及总酚酸含量Fig.1 Three methods for extraction of total solid,total salvianolic acids and its percentage注：不同字母和*代表P < 0.05，相同字母代表无显著差异(下同)。Note:Different alphabet represent P < 0.05,same alphabet represent no significance (same as below).

由图1显示，30%乙醇提取(EM)丹参所得的固体物总量最高为179.85g，显著高于陶瓷膜法(CM)所得的固体物含量，然而，经紫外分光光度法测定发现，30%乙醇提取总酚酸含量最低，为72.84%，所得的总酚酸总量为131.01 g，陶瓷膜虽然所得的固体物含量为158.63 g，但其总酚酸含量为85.52%，显著高于其余两组，三组在总酚酸量方面没有显著差异。说明陶瓷膜超滤方法能减少总固体物量，去除蛋白、鞣制等大分子物质，使得提取物的总酚酸含量显著提升。因此，从总酚酸的提取及节能降耗方面，用陶瓷膜超滤技术具有一定的优势。

2.2 不同孔径陶瓷膜对总酚酸的影响

为了进一步研究陶瓷膜孔径对总酚酸提取的效率及其含量，本研究用三种不同孔径(500、200、50 nm)规格的陶瓷膜对总固体物及总酚酸含量进行研究，结果显示随着陶瓷膜超滤孔径的减小，固体物含量有所下降，但是孔径没有显著影响，说明500 nm左右的陶瓷膜能够将大部分的蛋白、鞣质及其它大分子杂质除去。对总固体物中的总酚酸有最大限度的保留，但是随着孔径的减小，总酚酸含量是逐步上升的，说明在50～500 nm区间，还含有一些非酚酸类的大分子物质，如多糖等。因此，采用50 nm孔径的陶瓷膜对丹参水提液进行超滤，能够保证总酚酸含量的增加，但对提取效率没有显著影响。

2.3 不同孔径陶瓷膜对总酚酸中丹酚酸B含量的影响

丹酚酸B作为丹参总酚酸中的主要成分，具有多种生理活性，国内外对其研究较为广泛，因此，本研究通过液相色谱，建立丹酚酸B的标准曲线y= 8 065 421.701 1x- 2 186 885.813 5(R2=0.999 7)，研究不同陶瓷膜孔径下，所得总酚酸中丹酚酸B的含量。根据液相结果，表明经50 nm的陶瓷膜超滤所得总酚酸中丹酚酸B含量最高，根据峰面积相对比值达到90.55%，为进一步纯化丹酚酸B提供了含量更高的总提物。

图2 不同陶瓷膜孔径对总固体物、总酚酸量及总酚酸含量的影响Fig.2 Effect of different apertures of ceramic membrane on extraction of total solid,total salvianolic acids and its percentage

图3 不同孔径陶瓷膜滤过液的HPLC Fig.3 HPLC for filtered solution under different apertures of ceramic membrane

图4 不同陶瓷膜孔径所得总酚酸中丹酚酸B的含量Fig.4 The concentration of salvianolic acids B through different apertures of ceramic membrane

2.4 纯化丹酚酸B的条件

上述研究为纯化出98%以上的丹酚酸B提供了较好的丹参总酚酸原料，因此，本研究从节能降耗角度，利用大孔树脂HP- 20，以不同浓度的(水、10%、20%、40%、80%)甲醇进行洗脱，纯化丹酚酸B，根据洗脱结果，发现40%的甲醇洗脱部位，丹酚酸B含量最高，液相结果显示其纯度可达98.3%(图5)，为后续研究丹酚酸B的生物活性提供了标准原料，本方法从药物经济学角度是可行的。

图5 经大孔树脂HP- 20纯化后丹酚酸B的HPLC Fig.5 HPLC of salvianolic acids B after purification using macroporous resin HP- 20

综上，丹参总酚酸及丹酚酸B的工艺为，首先将丹参药材切片，20倍水回流提取2次，用50 nm孔径陶瓷膜进行超滤，滤液减压旋转蒸干，得总酚酸后复溶，再上大孔树脂HP- 20，40%乙醇洗脱，最终得丹酚酸B.

2.5 HepG2细胞胰岛素抵抗模型鉴定及细胞毒性研究

图6为正常HepG2细胞和胰岛素抵抗模型的HepG2细胞的葡萄糖含量实验结果。从图中可知，正常组HepG2细胞的葡萄糖含量为0.06 μmol/mg，而HepG2细胞胰岛素抵抗模型组中葡萄糖含量为0.2 μmol/mg。两者相差两倍多，与正常组相比，模型组细胞葡萄糖含量出现显著差异(P< 0.01)。

图6 Hep- G2细胞胰岛素抵抗模型鉴定 Fig.6 The identification model of Hep- G2 insulin resistance 注：**代表P < 0.01(下同)。Note:**represent P < 0.01 (same as below).

图7 HepG2细胞细胞毒性Fig.7 Cytotoxicity of HepG2

图8 正常HepG2细胞与胰岛素抵抗HepG2细胞的形态Fig.8 The HepG2 morphology of normal cell and insulin resistance cell 注：A1.正常HepG2细胞(放大倍数：200×)；A2.正常HepG2细胞(放大倍数：400×)；B1.胰岛素抵抗HepG2细胞(放大倍数：200×)；B2.胰岛素抵抗HepG2细胞(放大倍数：400×)。Note:A1.normal HepG2 (zoom:200×);A2.normal HepG2 (zoom:400×);B1.HepG2 insulin resistance (zoom:200×);B2.HepG2 insulin resistance (zoom:400×).

实验结果表明HepG2细胞胰岛素抵抗模型成功。

图7为丹酚酸B对HepG2细胞24小时的细胞毒性。从图中可知，随着浓度的増加，丹酚酸B对HepG2细胞的存活率下降，但浓度低于31.25 μg/mL时，对HepG2细胞没有显著的毒性(P> 0.05)，而浓度高于62.5 μg/mL时，对HepG2细胞有显著的毒性(P< 0.01)。因此，在后续实验中，选择浓度31.25 μg/mL以下都不会因细胞毒性而引起差异。实验中选取了高、中、低3个不同浓度，分别为30、15和7.5 μg/mL。

显微镜下观察，正常HepG2和胰岛素抵抗HepG2细胞均贴壁生长，细胞呈梭形、菱形、不规则形；两组细胞生长状态均未见明显差别。正常HepG2细胞与胰岛素抵抗HepG2细胞的形态见图8。

2.6 丹酚酸B对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖含量的影响

从图9中可以看出，和模型组相比，培养基中加入盐酸二甲双胍后，HepG2胰岛素抵抗细胞的葡萄糖含量显著降低(P<0.01)，但是并没有恢复到正常组水平。同时给药组随着丹酚酸B浓度的増加，HepG2胰岛素抵抗细胞的葡萄糖含量逐渐降低，但三个浓度和模型组相比都出现显著性的差异(P< 0.01)，同时可以看出高浓度丹酚酸B的葡萄糖含量降低显著，低浓度趋于平缓。

3 讨论

丹参总酚酸是丹参的主要活性成分群，具有广泛的药理活性[13]，而总酚酸中丹酚酸B是主要成分，众多研究证实丹酚酸B具有多种药理活性，如对心肌梗死具有保护作用[14]，明显改善心肌缺血等活性，市场上对丹参总酚酸和丹酚酸B的需求与日俱增。然而丹参总酚酸和丹酚酸B的纯化工艺主要还是通过传统的水提、浓缩、过大孔树脂[15]，虽然产率及纯度也能达到要求，但是工艺较为繁琐且容易造成资源浪费及产生过多的废弃物[16,17]。

图9 丹酚酸B对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖含量的影响Fig.9 The effect of salvianolic acids B on glucose content of HepG2 insulin resistance model 注：正常组为正常HepG2细胞，模型组为HepG2胰岛素抵抗细胞；阳性组为盐酸二甲双胍；给药组设置三个浓度梯度。Note:Normal group as HepG2;Model group as HepG2 insulin resistance；Positive group as metformin;Medicine group set three concentration.

本研究通过比较各提取方法发现，陶瓷膜虽然在总提物含量不如直接用30%醇提，但是其总酚酸含量显著高于其它两种提取方式，且进一步研究陶瓷膜的最佳工艺，对主要参数陶瓷膜孔径(500、200、50 nm)三种规格进行了研究，发现总酚酸含量随截留孔径缩小而增高，但固体物含量并未显著降低，说明500 nm可以有效除去大分子蛋白及鞣酸类成分，但是其他50～500 nm孔径的非酚酸类成分会残留，而50 nm则能有效去除杂质，一步过滤，丹酚酸B的含量可达到87%，并且经陶瓷膜过滤后，提取液由浑浊变为澄清，这对于后续开发丹参总酚酸的口服液提供了研究基础。为了进一步从总酚酸中纯化丹酚酸B，本研究用大孔树脂HP- 20对其进行纯化，发现40%乙醇洗脱，蒸干后丹酚酸B纯度即可达到98.3%。对于丹酚酸B用于其它药理实验研究和市场供应提供了工艺参考。另外，Huang等[18]研究发现丹酚酸B可改善2型糖尿病大鼠IR作用，但未从细胞水平上研究其降糖活性和细胞毒活性的评价。因此，基于上述工艺制备的丹酚酸B，本研究发现丹酚酸B浓度低于31.25 μg/mL时，对HepG2细胞没有显著的毒性，且具有显著的降糖活性，本研究从工艺优化及其细胞水平的降糖活性对丹酚酸B进行了研究，从节能降耗方向为工业化生产和研究丹酚酸B作为降糖候选药物提供了研究基础。