白肉灵芝水提物对衰老大鼠皮肤的作用研究

王 昱，何九军，张宗舟

陇南师范高等专科学校农林技术学院 陇南特色农业生物资源研究开发中心，成县 742500

人体衰老是一个全方位、多因素、系统的不可逆的过程，常伴随着结构的退行性变和机能的衰退。皮肤的衰老则表现为皮肤变薄、弹性减退、皱纹出现、干燥粗糙、色素沉着、血管突显等临床症状[1]。目前文献报道，皮肤的衰老与氧自由基损伤、免疫力衰退、端粒酶活性降低、炎性浸润等有关[2,3]。在延缓皮肤衰老的方面，外科手术运用皮肤提紧术、肉毒素注射、胶原皮下注射等方法治疗，但有一定的风险及副作用。中医从疏通经络气血、调整脏腑功能等入手[4]，是治疗皮肤衰老的有效方法之一。所以，将传统中医药的抗衰防老手段与现代科学技术相结合，开发用于皮肤保健及抗衰老的功能性食品是当前重要的课题。

肉灵芝学名太岁，《本草纲目》记载肉灵芝既可食用，也可入药，有“轻身不老、延年神仙”功效。《神农本草经》也提到肉灵芝无毒，能补中益气、增智慧[5]。近年来的研究表明，肉灵芝有效成分包括吡咯喹啉醌、氨基酸、维生素、微量元素等，对高血压、动脉硬化、癌症、风湿病等有一定作用，是一种高蛋白、低脂肪、具有丰富的钙、铁、锌等微量元素的生物体[6]。Xiong等[7]研究表明肉灵芝中的生物活性成分稳定性高且易通过机体血脑屏障，能促进新生神经元的发生，在治疗神经退行性疾病中具有更为广阔的前景。为了进一步探讨GLAE的药用和保健作用，本研究运用生物显微技术、彗星电泳、定量PCR等技术对GLAE的抗衰老作用机制进行了研究。

1 材料与方法

1.1 白肉灵芝水提物制备

取本实验室培养的白肉灵芝，烘干(35 ℃)子实体，提取DNA后扩增、电泳检测、条带纯化、测序(上海生物工程有限公司)。鉴定结果表明该样本为白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)。根据文献[7]，将白肉灵芝子实体干品粉碎，过筛(60 目)、提取(96 ℃水浴)、离心，收集上清，过滤，滤液冷冻干燥，得到白肉灵芝水提物。

1.2 动物模型建立与给药

50只健康SD大鼠，雌雄各半，许可证号：SCXK(甘)2005-0007，体质量200～250 g，适应性饲养一周后随机分为5组，每组10只：对照组、模型组、GLAE低剂量组、GLAE中剂量组和GLAE高剂量组。模型组和GLAE组大鼠采用颈背部皮下注射D-半乳糖(北京优尼康生物科技，批号MG05201)溶液300 mg/kg·bw[3]，同时GLAE低、中、高剂量组分别灌胃(50、100 和200 mg /kg·bw)的GLAE[8]，对照组每天注射等量的0.9% 生理盐水，连续处理7周。

1.3 组织学观察

采用颈椎脱臼法处死大鼠，用 8%硫化钠溶液脱毛后立即取大鼠背部正中皮肤修成常规大小，经4 %多聚甲醛液固定、石蜡包埋切片、染色后，显微镜观察。

1.4 胶原蛋白含量的测定

取背部皮肤的真皮，在培养皿中用无血清HBSS液(Hanks平衡盐缓冲溶液)冲洗，眼科剪剪碎，然后用弯头吸管反复吹打，0.125%胰蛋白酶和 0.01%的EDTA室温消化30 min，终止消化后弃去消化液，收集细胞按照ELISA检测试剂盒(ELx800，美国BioTek公司)说明书操作，检测Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白的含量。

1.5 彗星电泳检测皮肤细胞DAN的损伤

根据文献制片[9]：第一、二层分别铺琼脂糖和上述制备的细胞悬液。将制备好的载玻片置于4 ℃固定30 min 后，浸没于4 ℃预冷的裂解液(2.5 M NaCl、100 mM Na2EDTA、10 mM Tris-HCl pH 10、1%肌氨酸钠、1%Triton和1%DMSO)中裂解2 h。在4 ℃盛有碱性电泳缓冲液(1 mM EDTA，300 mM NaOH)的电泳槽(DYCPZ型，北京市六一仪器厂)静 置20 min，使DNA 解旋，然后在25 V 电压，300 mA 电流下电泳(DYY- IB型电泳仪，北京市六一仪器厂)20 min。Tris- HCl缓冲液(4 ℃)中和至中性，用溴化乙锭(广州化学试剂厂)溶液染色30 s～1 min，蒸馏水洗涤。在倒置荧光显微镜(DMI3000B，Leica)下用515～560 nm 的激发光观察单细胞电泳图像，每样做3张片子，拍照观察DNA损伤细胞(尾长大于头部半径的细胞)。实验结果以彗星率%表示。

1.6 PCR检测皮肤MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表达

取大鼠皮肤在2 mL 的离心管(加入1 mL Trizol)中反复研磨，离心(14 000 rpm)10 min，然后按照PCR试剂盒说明书进行酚- 氯仿抽提RNA、逆转录反应、实时荧光PCR扩增，最后采用 ABI 7 500 软件分析，用2-△△Ct方法进行相对定量。(引物由上海涵悦生物科技有限公司设计，上海生工生物技术有限公司合成，引物信息见表1。Taka Ra公司提供RNA抽提试剂盒、反转录试剂、定量PCR试剂)。

表1 目的基因引物序列

1.2.8 数据处理

2 结果

2.1 GLAE对大鼠皮肤组织结构的影响

对照组大鼠皮肤组织分层清楚、结构完整，真皮层的胶原纤维排列整齐、分布均匀，皮肤附属器数量较多。模型组大鼠表皮变薄，结构不完整，皮肤附属器减少；真皮和皮下结缔组织被致密、无弹性的纤维化组织所替代，皮肤纤维化严重。GLAE高剂量组大鼠皮肤组织形态接近对照组，表皮较厚，组织结构完整，皮肤附属器较多(见图1)。

图1 GLAE对大鼠皮肤组织病理学影响Fig.1 Effect of GLAE on the skin histopathology in rats注：A.对照组；B.模型组；C.GLAE高剂量组，标尺示50 μm。Note:A.control group;B.model group;C.GLAE high- dose group,bar=50 μm.

2.2 各实验组大鼠皮肤Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的含量

与对照组相比，模型组成纤维细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量显著降低(P< 0.01)。与模型组相比，GLAE低、中、高剂量组成纤维细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量均呈升高趋势(P<0.01，P<0.05)(见图2)。

2.3 各实验组大鼠皮肤细胞的DNA损伤

彗星电泳又称单细胞凝胶电泳，若细胞核DNA断裂成片段，在电泳条件下，其移动的速度快于细胞核部分，从而在电泳图上形成彗星状图形，尾部的长短或面积大小代表细胞核DNA损伤的程度，正常细胞的细胞核呈圆形(见图3)。由图4可知，各实验组大鼠皮肤细胞的DNA均有不同程度断裂，均出现了彗星状图形。与对照组相比，模型组大鼠皮肤细胞DNA的彗星率极显著升高(P< 0.01)。与模型组相比，GLAE低、中、高剂量组大鼠皮肤的细胞DNA彗星率均呈降低趋势(P< 0.05，P< 0.01)。

图2 GLAE对大鼠皮肤Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量的影响Fig.2 Effects of GLAE on contents of skin typeⅠand type Ⅱ collagen in rats注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P > 0.05)。Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05).

图3 各实验组大鼠皮肤细胞DNA的彗星电泳图 Fig.3 Comet electrophoretogram of skin cell in each experimental group注：A.对照组；B.模型组；C.GLAE高剂量组，标尺示20 μm。Note:A.control group;B.model group;C.GLAE high- dose group,bar=20 μm.

图4 GLAE对大鼠皮肤细胞DNA损伤的影响 Fig.4 Effect of GLAE on skin cell DNA damage of rats注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P > 0.05)。Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05).

2.4 各实验组大鼠皮肤组织MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表达

由表2可知，与对照组相比，模型组大鼠皮肤组织MAP3K5和TGF-β1 mRNA表达量极显著下降，PLOD2 mRNA表达量极显著升高(P< 0.01)；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组大鼠皮肤组织MAP3K5和TGF-β1 mRNA表达量显著升高(P< 0.05，P< 0.01)，PLOD2 mRNA表达量呈降低趋势(P< 0.05，P< 0.01)。

表2 GLAE对大鼠皮肤组织MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表达的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P< 0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P> 0.05)。

Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P< 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P> 0.05).

3 讨论

皮肤衰老时表现出表皮变薄、胶原纤维排列紊乱、细胞结构异常等明显的形态学变化[10,11]。人体皮肤细胞外基质的主要成分是胶原蛋白，其中的Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白交织成网，支撑起整个皮肤，而当胶原蛋白含量降低时，皮肤的弹力明显下降[12]。本实验结果显示，模型组大鼠皮肤的各层组织间层次不清楚，表皮变薄，Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的含量降低，DNA损伤加剧。而经GLAE作用后，大鼠皮肤结构完整，表皮增厚，真皮内胶原纤维增多，排列比较紧密、整齐，DNA损伤程度明显降低，这表明GLAE对衰老大鼠皮肤组织的损伤有明显的保护作用。

在生理状态下，细胞凋亡在调节机体生长发育及维持机体细胞平衡中起到了重要的调控作用，确保细胞达到最佳平衡的状态。在病理条件下，细胞凋亡会引起机体结构发生退行性改变，引发许多老年性疾病，即与皮肤衰老存在一定的关联性[13]。MAP3K5 基因是氧化应激诱导的细胞凋亡必需基因，参与调节炎症反应，也可作为抑癌基因发挥促凋亡作用[14,15]。MAP3K5基因在皮肤中表达下调，皮肤细胞凋亡明显加剧，导致皮肤病理改变[1]。因而，MAP3K5基因可能是抑制细胞凋亡、抗皮肤衰老的基因之一。转化生长因子-βl(TGF-βl)是一种多效性、多功能性的高效生长分化因子，可以通过抑制胶原酶的活性来抑制基质降解，促进胶原合成[16]。研究表明，TGF-βl能促进成纤维细胞等间充质起源细胞增殖、抑制细胞凋亡及促进细胞外基质的合成[17]。在体外实验中发现，血管内皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子和胰岛素样生长因子的水平与外源性的TGF-βl 呈正向关系[18]，成纤维细胞增殖活性率提高，I、II型胶原蛋白含量及其mRNA的表达增加，促进真皮内结构的恢复和重建[19]。本实验结果显示，模型组大鼠皮肤中基因MAP3K5表达显著降低，经GLAE作用后，衰老大鼠皮肤组织中基因MAP3K5、TGF-βl表达量显著增加，提示GLAE可通过上调MAP3K5和TGF-βl基因的表达来抑制细胞凋亡和基质降解，促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成，从而发挥延缓皮肤衰老的作用。

赖氨酸羟化酶(lysyl hydrxoylase, LH)与胶原蛋白的形成及稳定有着密切的关系。LH 的主要功能是催化胶原蛋白分子中的赖氨酸羟化成羟赖氨酸，把胶原蛋白分子共价交链形成稳定物，大量的胶原蛋白无法降解，过度堆积在机体组织中，从而使皮肤松弛、组织纤维化等衰老表现[20]。LH 家族中的 LH1、LH2、LH3 是分别由PLOD1、PLOD2、PLOD3 编码的，其中的PLOD2 表达量增加时，LH2 活性增强，从而促使胶原纤维过度堆积聚集[21]。本研究结果表明，模型大鼠皮肤组织中 PLOD2 基因表达显著增加，而经GLAE作用后，其表达显著下降，说明GLAE可通过下调 PLOD2 的表达，降低 LH2 的活性，减少胶原蛋白在皮肤组织的堆积，在增加皮肤弹性和减少皮肤皱纹形成方面有重要作用。

综上所述，GLAE对衰老大鼠皮肤组织的损伤有明显的保护作用，这种作用可能与增加胶原蛋白含量、抑制皮肤细胞DNA损伤、调节MAP3K5、TGF-β1和PLOD2基因的表达有关。对于肉灵芝中有效生物成分的药用价值，目前无完备的科学解释，还需大量的药理验证。