基于UPLC- Q- TOF- MS对野马追内酯F在大鼠体内代谢产物的分析

秦伟瀚，刘 翔，王云红，宋小仙，阳 勇，李 卿

重庆市中药研究院，重庆 400065

野马追为菊科植物轮叶泽兰(EupatoriumlindleyanumDC.)的干燥地上部分[1]。又名白鼓钉、化食草等。除新疆以外广泛分布于全国各地，其中江苏省盱眙县为该药材的道地产区[2,3]。早在1988年江苏省地方药材标准就已有收载，现收录于2015年版《中华人民共和国药典》[4]。本品味苦、性平，归肺经，具有化痰、止咳、平喘之功效，常用于治疗痰多、咳嗽、气喘等病症[5,6]。随着对野马追药材研究的不断深入，新近药理报道还指出其具有降血脂、抗动脉粥样硬化等作用[7- 13]。课题组前期通过对野马追提取物研究发现，其降血脂效果与辛伐他汀相当，部分药理检测指标还优于辛伐他汀，但起效物质和起效过程尚不明确，阻碍了其进一步开发和应用。

随着高分辨质谱在中药化学领域的快速普及和发展，多重质量亏损过滤(MMDF)技术在海量数据挖掘过程中优势逐渐显现，对于目标化合物筛查、药物代谢及天然产物鉴定等方面具有越来越大的应用空间。借助超高效液相色谱- 飞行时间质谱联用(UPLC- Q- TOF- MS)技术，分析中药复杂成分和中药代谢[14]，能够省略分离纯化过程的同时鉴定痕量的药物及其代谢产物；同时，在药物代谢物筛选与表征过程中，具有去除背景离子干扰，排除假阳性，提高分析效率等诸多明显优势。倍半萜内酯是野马追的主要特征性成分，野马追内酯F(eupalinolide F)在倍半萜成分中含量较高，故本研究以探究大鼠血浆中野马追内酯F的代谢产物为目标，采用高分辨质谱，基于多重质量亏损和动态背景扣除技术，系统分析了野马追内酯F在大鼠体内的生物转化过程，为明确野马追药材的药效物质基础及深入开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试药

1.1.1 仪器

LC- 30A型超高效液相色谱仪(日本，岛津公司)：二元高压泵、自动进样器、柱温箱;Triple TOFTM4600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪(美国，AB公司)：Analyst 1.6工作站、PeakView 1.2.0.3数据处理软件、MetabolitePilot 1.5.0.8532代谢产物鉴定软件;DW- 86L486型超低温冰箱(中国，中科美菱公司)；Microfuge 20R型超高速离心机(美国，贝克曼库尔特公司)。

1.1.2 实验动物

SD大鼠，SPF级，10只，雄性，体重200±20 g，由重庆市中药研究院实验动物研究所提供，实验动物生产许可证号SCXK(渝)2012- 0006，动物合格证号0003054。动物饲养于重庆市中药研究院药化所，动物实验环境(温度20～25 °C，湿度50%～65%)，自由摄食和饮水；并按实验动物使用的“3R”原则给以人道主义关怀。

1.1.3 药材与试剂

野马追内酯F对照品为自制，经高效液相色谱(HPLC)归一化法测定，纯度>95%。乙腈、甲醇、水(色谱纯级，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯级，美国ACS公司)；乙醇(分析纯，重庆川东化工公司)。

1.2 野马追内酯F灌胃给药

取SPF级SD大鼠10只，饲养3天后禁食12 h，自由饮水。按照10 mg/kg体重剂量灌胃，分别于给药后30、60、90、120、180、240 min眼眶静脉丛取血0.5 mL于装有肝素钠的EP管中，于10 625×g离心10 min取上层血浆，- 80 °C冰箱保存，备用。

1.3 样品采集与处理

按照采血时间点，精密吸取10只大鼠血浆样品各50 μL于1.5 mL EP管中，加入色谱甲醇600 μL后涡旋混匀2 min，于10 625×g离心10 min，分别吸取上清液和空白对照液2 μL进样，进行UPLC- Q- TOF- MS分析。

1.4 实验条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna- C18(2 mm×100 mm,3 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度程序：0～2.0 min，6%B；2.0～10.0 min，6%～80%B；10.0～12.0 min，80%B；12.0～12.1 min，80%～6%B；12.1～15.0 min，6%B；流速：0.2 mL/min，柱温：30 °C，进样量：2 μL。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，负离子模式采集数据，喷雾电压(IS)：- 4 500 V；雾化气压力(GS1)：50 Psi；气帘气压力(CUR)：15 Psi；辅助气压力(GS2)：45 Psi；离子源温度(TEMP)：600 oC；簇裂解电压(DP)：55 V；碰撞能量(CE)：40 V；碰撞能量滚动区间(CES)：15 V；检测模式为IDA(信息关联采集模式)，多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)为触发二级的条件，满足该条件优先进行二级扫描。

1.5 代谢产物分析鉴定

查阅野马追化学相关文献，采用ChemDraw软件建立野马追内酯F的mol格式文件，导入PeakView软件，结合Formula Finder、Mass Calculators等功能，对野马追内酯F标准品和血浆样品进行定性分析，并将上述结果代入MetabolitePilot软件，对该化合物产生的所有代谢产物进行分析鉴定。

2 结果与讨论

2.1 野马追内酯F质谱鉴定分析

采用UPLC- Q- TOF- MS对野马追内酯F标准品和血浆样品进行分析。如图1B、图2所示，野马追内酯F在ESI负离子模式中的母离子[M- H]-的质荷比为m/z419.173 4，经质谱电离裂解作用分别脱去116.051 7、176.072 3、220.063 4、264.089 1、304.133 3 Da生成质荷比为m/z303.121 7、243.101 1、199.110 0、155.083 4、115.040 1的碎片离子，利用PeakView软件的Mass Calculators功能计算出C5H8O3、C7H12O5、C12H12O4、C14H16O5、C17H20O的理论值分别为116.046 8、176.067 9、220.073 0、264.099 2、304.130 5 Da，与脱去碎片的实际值之差均小于0.01 Da。通过上述对二级碎片裂解规律的分析并结合化合物结构特点，判定该化合物应为野马追内酯F。

将野马追内酯F分子式(C22H28O8)代入PeakView软件的XIC Manager筛查表中对该化合物保留时间、强度等质谱参数进行提取处理；由图1A、1C可知，有效部位在5.872 min处有超过200 000 cps响应，而血浆样品在5.888 min处有接近10 000 cps响应，进一步对其MS/MS碎片进行比较分析(如图1B、1D)，发现两者的裂解碎片质荷比基本一致，据此判断血浆样品中含有野马追内脂F。由初步的量时曲线(图3)可以看出，采血时间为灌胃后30 min时，血浆样品中野马追内酯F离子强度为8 773 cps；

图1 野马追内酯F的提取离子图和二级质谱图Fig.1 Extraction ionogram and secondary mass spectrogram of eupalinolide F注：A.对照品提取离子图；B.对照品二级质谱图；C.血浆样品提取离子图；D.血浆样品二级质谱图。Note:A.XIC of effective fraction;B.MS/MS of effective fraction;C.XIC of plasma;D.MS/MS of plasma.

图2 野马追内酯F裂解规律图Fig.2 Pyrolysis chart of eupalinolide F

图3 野马追内酯F量时曲线图Fig.3 Mass spectrometric response intensity and time curve of eupalinolide F

当采血时间为60 min时，野马追内酯F的血药浓度达到最大值；之后直到240 min，血浆样品中野马追内酯F离子强度逐渐降低。由上述数据分析结果可知，入血后野马追内酯F的离子强度可以达到标准品的1/20，可能与该药物吸收代谢特性以及血浆样品的基质效应等因素相关。

2.2 野马追内酯F在大鼠体内代谢转化分析

采用ChemDraw软件建立野马追内酯F的mol格式文件，导入MetabolitePilot软件中，获取该化合物理论裂解参数，再将标准品的Q- TOF数据作为血浆样品的参比对照导入该软件，以2.2项下的保留时间、二级碎片等分析结果对野马追内酯F实际质谱信息进行筛选匹配，建立该化合物的质谱数据库；MetabolitePilot软件会自动对以野马追内酯F为母核的所有代谢产物进行分析处理，再结合相应代谢产物的二级碎片裂解规律进行补充鉴定，代谢产物鉴定结果见表1、图4。

通过大鼠体内生物转化分析研究，以野马追内酯F为原型共鉴定出了55个代谢产物，其中I相代谢包括氢化、氧化、酯键水解、成酮、脱氧、甲基化、去甲基等12种反应类型；II相代谢包括葡萄糖苷结合、葡萄糖醛酸结合、乙酰化、磷酸酯化、硫酸酯化、谷胱甘肽结合、半胱氨酸结合、谷氨酰胺结合、硫磺酸结合等10种反应类型；发生两次以上代谢过程均包含水解反应，与化合物原型含有两个酯键和一个内酯的结构特征相符；I相代谢中氧化反应较多，可以是单纯加氧或成酮，而还原反应以不饱和双键加氢为主；单独的II相反应只有谷胱甘肽结合(M9)、葡萄糖醛酸结合(M10)和乙酰化(M12)，其余17个发生了结合反应的II相代谢产物均伴随了I相水解反应。由此可见I相反应过程通过氧化、还原、水解在野马追内酯F分子结构中引入或脱去功能基团从而发挥药效活性或失去活性；II相反应则通过与内源性物质经共价键结合，生成极性大、水溶性高的结合物，经尿液排泄。

表1 野马追内酯F代谢产物鉴定结果

续表2(Continued Tab.2)

编号No.保留时间tR(min)代谢过程Metabolic reaction分子式Formula测量值Measurde mass (m/z)偏差Deviation(ppm)峰面积Peak Area得分Score(%)M415.36Loss of C2H2O2C20H26O6361.163 8-4.1136 00087.0M425.40Demethylation and HydrogenationC21H28O8407.170 3-2.192 70077.4M435.48Loss of C2H2O and C5H6O3C15H20O4263.125 5-2.887 60077.6M445.58Loss of C2H2O2+Bis-DemethylationC18H22O6333.134 81.4115 00075.0M455.74Loss of C5H6O2C17H22O6321.131 0-0.367 80081.8M465.81Loss of C17H20O5+Glutamine ConjugationC10H16N2O5243.098 70.295 60059.3Parent5.88Metabolite prototype C22H28O8419.169 7-3.456 90093.8M475.91Loss of C2H2O+Loss of WaterC20H24O6359.147 6-1.757 90093.1M485.96Loss of C5H6O3 and O+Demethylation and Methylene to KetoneC16H18O5289.107 9-0.9136 00076.6M496.08MethylationC23H30O8433.189 31.8127 00073.4M506.08Loss of C2H2O and C5H6O3+Sulfate ConjugationC15H20O7S343.083 2-0.4126 00047.8M516.29Loss of O and C2H2O2+Demethylation and Glucuronide ConjugationC25H32O11507.188 32.289 70050.7M526.34Loss of O and C2H2O2+AcetylationC22H28O6387.191 82.1170 00064.7M536.83Loss of C2H2O and C5H6O3+MethylationC16H22O4277.141 3-1.675 60071.0M547.04Loss of C2H2O2 and C5H6O3+Di-HydrogenationC15H24O3251.161 4-1.5119 00044.4M557.57Loss of O and C2H2O2+MethylationC21H28O5359.169 3-4.6106 00056.7

图4 野马追内酯F代谢过程图Fig.4 Metabolic process diagram of eupalinolide F

3 结论

本研究进行了野马追内酯F的大鼠体内生物转化分析，共鉴定出了55个代谢产物，其中I相水解反应是主要代谢过程；在血浆中检出的野马追内酯F离子强度可以达到灌胃标准品的1/20，表明该化合物的吸收程度较高，但该化合物起效过程和起效机制尚不明确，课题组拟后续通过血浆蛋白结合率、药代动力学、P450酶体外代谢等实验进行深入探讨。野马追的主要化学成分包括黄酮、萜、生物碱、甾醇等类成分[15,16]，其中野马追内酯F是属于吉马烷型倍半萜类的一种，是野马追主要特征有效成分，据笔者统计，野马追萜类成分包括二萜、倍半萜和三萜，该类化合物共计38种之多[17]，而市面上销售的纯品仅野马追内酯A、野马追内酯B和野马追内酯H，想要对该类化合物的体内代谢产物进行逐一分析鉴定，存在着较大困难，本研究基于前期对野马追内酯F进行的分离、纯化工作，在利用高分辨质谱对野马追内酯F化学结构进行定性解析基础上，采用MetabolitePilot软件对野马追内酯F的所有代谢产物进行快速分析鉴定，为明确野马追的体内起效物质基础提供了新思路，也为野马追的新药开发及临床应用等提供科学参考。