连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞抗肿瘤机制的研究

李 飞，杨添雁，沙秀芬，李 群

四川师范大学生命科学学院，成都 610101

肝癌是发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤[1]，具有发病年龄轻、恶性程度高、起病隐匿、进展快等特点[2]。目前肝癌治疗手段主要包括手术、化疗和放疗等，但手术切除不彻底、复发率和转移率高是影响肝癌临床治疗疗效的主要问题，其治疗的总体疗效仍不理想[3]。而天然抗肿瘤药物因具有疗效显著、副作用小、作用独特与研究成本低的特点逐渐广泛应用于临床治疗。

连香树(Cercidiphyllumjaponicum)又名山白果、云义树和五君树，是连香树科连香树属的一种古老落叶高大乔木[4]。主要分布于日本和我国山西南部、四川西部与东南部等海拔400～2 500 m的常绿和落叶阔叶混交林中[5]。连香树果实主要治疗小儿的惊风抽搐肢冷等症状；树皮煎水后饮服，对感冒、痢疾等疾病具有特殊疗效[4]；其甲醇提取物能抑制蔬菜病原菌的活性[6]。虽然连香树拥有较高药用价值，但缺乏对其功效的系统科学研究。目前对连香树的研究大多数是关于濒危状况、培育繁殖、群落结构、遗传多样性和生态特性等方面，而针对其次生代谢和功能开发方面研究较少。本实验采用连香树精油处理人肝癌SMMC- 7721细胞，探究其对该细胞增殖、凋亡与自噬的影响，并检测自噬与凋亡相关蛋白探究其可能的抗肿瘤机制，进一步为肝细胞癌的治疗提供依据，同时为连香树的开发利用提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 受试细胞株

人肝癌细胞株SMMC- 7721细胞购自成都哈里生物工程有限公司，由本实验室培养。

1.2 供试材料

连香树叶片采自海拔1 800米的四川省广元市旺苍县盐井河采育场，经宜宾学院魏琴教授鉴定为连香树科连香树属连香树(Cercidiphyllumjaponicum)。在实验室将叶片干燥后粉碎至粉末，通过水蒸气蒸馏法提取连香树叶片中的精油。

1.3 主要仪器

G154TW型高压蒸汽灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)；飞鸽牌TGL- 16B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；stratos型Thermo Fisher Scientific高速冷冻离心机(上海天呈医流科技股份有限公司)；MD/Spectra Max M2多功能细胞分析仪(美国Molecular Devices公司)；Leica DMIL LED型倒置显微镜(北京冠普佳科技有限公司)；Leica DM3000型荧光显微镜(北京瑞科中仪科技有限公司)；cytoflex流式分析仪(Beckman)。

1.4 主要试剂

吖啶橙/溴化乙锭AO/EB、碘化丙啶PI、噻唑兰MTT(Biosharp生物公司)；二甲基亚砜DMSO(Amresco生化公司)；RMPI- 1640液体培养基、无支原体新生牛血清、胰蛋白酶(成都哈里生物工程有限公司)；5- 氟尿嘧啶(中国食品药品检定研究院)；Annexin V- FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；JC- 1线粒体膜电位试剂检测盒(上海碧云天生物公司)；磷酸氯喹CQ(上海陶素生化科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

人肝癌细胞SMMC- 7721细胞采用含10%小牛血清的RPMI- 1640完全培养基，置于37 ℃，5% CO2的二氧化碳培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，用含0.25% EDTA的胰酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 MTT法检测人肝癌SMMC- 7721细胞增殖活性

取对数生长期的SMMC- 7721细胞100 μL(1×104个/mL)接种于96孔板。培养24 h后，分别加入98 μL培养基和2 μL 终浓度为0.0375、0.075、0.15、0.3、0.6 mg/mL 的连香树精油，并设置空白对照、阴性对照、阳性对照(80 μg/mL 5- 氟尿嘧啶)和溶剂对照(DMSO)。培养12、24、48 h后，加入20 μL MTT，4 h后吸去上清液，加入150 μL DMSO，用酶标仪检测480 nm处的吸光度，计算细胞抑制率：

2.3 流式细胞仪检测人肝癌SMMC- 7721细胞周期

取对数生长期的SMMC- 7721细胞2 mL(1×106个)接种于6孔板。预培养24 h后，分别加入0.15、0.3、0.6 mg/mL的连香树精油20 μL，并以DMSO作为溶剂对照。培养24 h后收集细胞。加入预冷的70% 的乙醇2 mL置于4 ℃冰箱固定24 h。PBS洗涤后加入1 mg/mL的RNAnase和碘化丙啶(PI)各25 μL，避光染色30 min，用ACEA NovoCyte流式细胞仪检测细胞周期变化。

2.4 人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡检测

2.4.1 细胞凋亡率检测

参照2.3细胞前期处理方法，培养24 h后收集细胞。参照AnnexinV- FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，用ACEA NovoCyte流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.4.2 细胞凋亡形态观察

参照2.3细胞前期处理方法，培养24 h后收集细胞。PBS重悬细胞，加入100 mg/mL的AO/EB染液5 μL，取混匀后的细胞悬液10 μL于载玻片，用Leica DM3000型荧光显微镜下观察形态并拍照。

2.4.3 线粒体膜电位检测

参照2.3细胞前期处理方法，培养24 h后收集细胞。重悬细胞，加入1 mL JC- 1染色工作液，二氧化碳培养箱孵育40 min。离心5 min，弃上清液，JC- 1染色缓冲液(1×)洗涤2次，加入2 mL培养基。取150 μL细胞悬液于黑色96孔板，测定JC- 1聚合体和JC- 1单体的吸光度。

2.5 人肝癌SMMC- 7721细胞自噬检测

参照2.3细胞前期处理方法，在透射电子显微镜下观察细胞自噬体形态并拍照，用Western blot法测定SMMC- 7721细胞中LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin- 1蛋白表达水平。

2.6 人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡与自噬的联系

参照2.3细胞前期处理方法，培养24 h后收集细胞。弃上清液，用Western blot方法检测SMMC- 7721细胞中LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Bcl- 2蛋白表达水平。

2.7 统计学分析

所有实验数据采用统计软件SPSS 22.0处理，Probit 法计算 IC50值，单因素方差分析显著性差异，以P<0.05为差异有统计学意义，各实验组均重复3次。

3 结果与分析

3.1 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞增殖的影响

连香树精油对SMMC- 7721细胞增殖的影响结果见图1，由图1可知，精油对人肝癌SMMC- 7721细胞有明显抑制作用，且呈剂量依赖性。处理12、24、48 h后的IC50值分别为0.108、0.104、0.132 mg/mL，可得出24 h处理后IC50值为最小，因此选取24 h作为后续试验的处理时间。

图1 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞活力的影响Fig.1 Effect of C.japonicum oil on the viability of human hepatoma SMMC- 7721 cells注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，显著差异；**P<0.01，极显著差异。Note:Compared to the solvent control group, *P<0.05,significant difference;**P<0.01,extremely significant difference.

3.2 连香树精油使人肝癌SMMC- 7721细胞阻滞在G2 /M期

图2 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞周期的影响Fig.2 Effect of C.japonicum oil on the cell cycle of human hepatoma SMMC- 7721 cells注：a，b，c，d依次为0、0.15、0.3、0.6 mg/mL的连香树精油。Note:a:control group;b:0.15 mg/mL;c:0.3 mg/mL;d:0.6 mg/mL.

3.3 连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡

3.3.1 连香树精油对SMMC- 7721细胞凋亡率的影响

用流式细胞仪检测连香树精油诱导SMMC- 7721细胞凋亡率的结果见图3，随着连香树精油浓度的升高，细胞凋亡率呈剂量依赖性升高。当处理浓度为0 mg/mL时，细胞凋亡率(早凋+晚凋)为4.19%；当处理浓度为0.6 mg/mL时，细胞凋亡率(早凋+晚凋)为20.58%。

3.3.2 AO/EB染色观察人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡形态

AO/EB染色后SMMC- 7721细胞凋亡形态结果见图4，由图4可知，随着连香树精油浓度的升高，绿色荧光的活细胞数目减少，呈桔红色或红色荧光的凋亡细胞数增多。

图3 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡率的影响Fig.3 Effect of C.japonicum oil on the apoptosis rate of human hepatoma SMMC- 7721 cells注：a，b，c，d依次为0、0.15、0.3、0.6 mg/mL的连香树精油。与溶剂对照组相比，*P<0.05，显著差异；**P<0.01，极显著差异。Note:a:control group;b:0.15 mg/mL;c:0.3 mg/mL;d:0.6 mg/mL.Compared to the solvent control group, *P<0.05,significant difference;**P<0.01,extremely significant difference.

图4 AO/EB染色观察连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡Fig.4 AO/EB staining observe the apoptosis of human hepatoma SMMC- 7721 cells induced by C.japonicum oil注：a、b、c、d依次为0、0.15、0.3、0.6 mg/mL的连香树精油。Note:a:control group;b:0.15 mg/mL;c:0.3 mg/mL;d:0.6 mg/mL.

3.3.3 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞线粒体膜电位的影响

经JC- 1法测定连香树精油处理人肝癌SMMC- 7721细胞后胞内线粒体膜电位的变化情况结果见表1，由表1可知，随着连香树精油浓度的升高，SMMC- 7721细胞内的膜电位比值呈剂量依赖性下降。表明连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞线粒体膜电位下降。

表1 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞的线粒体膜电位的影响

Note：Mean±STDEV,n=3;Different letters in the same column show significant difference atP=0.05 level.

3.3.4 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞Caspase1和8的影响

在预制装配式住宅建筑过程中，施工人员时常会用到超薄无机的预制外墙，相比较传统的建筑结构，利用这种新型的外墙解决了固有的稳定性差的问题，并且在施用这项技术之前，项目施工人员将衔接性和保温问题都列为考虑因素之内，不仅有效地提高了预制装配式项目的使用年限，而且还减少了在使用过程中出现的脱落或者剥离的恶劣现象，为现场工人提供了保护伞，提升了项目的安全性能[2]。

连香树精油对凋亡与焦亡相关蛋白的影响如表2所示，由表2可知，随着连香树精油浓度的升高，SMMC- 7721细胞内Caspase8相比对照组无明显上调趋势，Caspase1相比对照组先下降后上升但无明显升高趋势，表明连香树精油没有明显通过诱导死亡受体介导的细胞凋亡和活化Caspase1介导的细胞焦亡两条途径来诱导细胞死亡。

表2 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞中Caspase8和Caspase1的影响

3.4 连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞自噬

3.4.1 透色电镜观察自噬体形态

透色电镜下自噬体形态如图5所示，由图可知，当连香树精油浓度为0 mg/mL时，细胞结构完整，核膜清晰；当连香树精油浓度为0.3 mg/mL时，细胞内染色质呈无规律的块状分布，出现许多明显的双层膜结构或者包裹着需要降解的细胞器的自噬体，说明连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞自噬。

图5 透射电镜观察连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞自噬Fig.5 Transmission electron microscopy observe the autophagy of human hepatoma SMMC- 7721 cells induced by C.japonicum oil注：a (5.0 μm)、b (5.0 μm)、c (1.0 μm)依次为0、0.3、0.3 mg/mL的连香树精油。Note:a (5.0 μm):control group;b (5.0 μm):0.3 mg/mL;c (1.0 μm):0.3 mg/mL.

3.4.2 连香树精油对自噬相关蛋白的影响

连香树精油对自噬相关蛋白的影响如图6所示，结果表明，随着连香树精油浓度的升高，细胞中自噬相关蛋白LC3- Ⅰ逐渐向LC3- Ⅱ转化，造成LC3- Ⅱ蛋白的大量积累，Beclin- 1的蛋白水平明显上调，表明连香树精油诱导了人肝癌SMMC- 7721细胞发生较高水平的自噬。

图6 连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞中自噬相关蛋白的影响Fig.6 Effect of C.japonicum oil on autophagy- associated protein in human hepatoma SMMC- 7721 cells注：1、2、3、4依次为0.6、0.3、0.15、0 mg/mL的连香树精油。Note:1:0.6 mg/mL;2:0.3 mg/mL;3:0.15 mg/mL;4:control group.

3.5 连香树精油诱导的自噬抑制人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡

为研究连香树精油诱导SMMC- 7721细胞自噬在凋亡中的作用，将自噬抑制剂氯喹和连香树精油共同孵育SMMC- 7721细胞，自噬相关蛋白表达结果如图7所示。由图7可知，LC3- Ⅰ蛋白积累较多，LC3- Ⅱ蛋白减少，表明自噬受到抑制。抑制连香树精油诱导SMMC- 7721细胞的自噬后，蛋白表达结果如图8所示，Bcl- 2抗凋亡蛋白随连香树精油浓度的增大而明显下调，表明在抑制了连香树精油诱导人肝癌SMMC- 7721细胞的自噬后促进了连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞的凋亡作用。

4 结论

近年来，植物来源的天然提取物及其次生代谢产物生物活性的研究备受关注[7]，特别是植物抗肿瘤药物领域发展迅猛。目前已筛选出具有抗肿瘤活性的植物提取物多达3万种，应用于临床的抗肿瘤药物已有80多种[8]。具有生理或者药理活性的植物提取物能够通过阻滞细胞周期，诱导细胞发生凋亡和自噬等方式来抑制并杀死肿瘤细胞[9]。本研究也从这几个方面研究了连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞的作用情况。

图7 抑制自噬后连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞中自噬相关蛋白的影响Fig.7 Effects of C.japonicum oil on autophagy- related proteins in human hepatoma SMMC- 7721 cells after autophagy inhibition注：CQ1、CQ2、CQ3、CQ4依次为自噬抑制剂氯喹与0.6、0.3、0.15、0 mg/mL的连香树精油共同孵育。Note:CQ1:0.6 mg/mL+CQ;CQ2:0.3 mg/mL+CQ;CQ3:0.15 mg/mL+CQ;CQ4:control group+CQ.

图8 抑制自噬后连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞中Bcl- 2蛋白的影响Fig.8 Effect of C.japonicum oil on Bcl- 2 protein in human hepatoma SMMC- 7721 cells after autophagy inhibition注：CQ1、CQ2、CQ3、CQ4依次为自噬抑制剂氯喹与0.6、0.3、0.15、0mg/mL的连香树精油共同孵育。Note:CQ1:0.6mg/mL+CQ;CQ2:0.3mg/mL+CQ;CQ3:0.15mg/mL+CQ;CQ4:control group+CQ.

细胞有丝分裂的正常运行对细胞的增殖和生长有着重要的调控作用，阻滞细胞周期导致细胞周期紊乱已经成为药物作用于肿瘤细胞的新靶点[10]。研究表明，蛇床子通过阻滞N87胃癌细胞G2/M期从而抑制细胞增殖[11]；SHIP2 同样阻滞喉癌Hep- 2细胞的G2/M期[12]。在本研究中，连香树精油处理人肝癌SMMC- 7721细胞24 h后，细胞中G0/G1期的比例由73.47%下降到66.27%，G2/M期的比例由7.14%升高至11.14%，推测连香树精油通过将部分人肝癌SMMC- 7721细胞阻滞在G2/M期达到抑制细胞分裂的作用。

细胞凋亡是一个在相关基因调控下进行高度程序化的过程，遵循固有的程序性自杀机制，细胞发生凋亡时可以形成凋亡小体，最后被邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬[13]。在本实验中，连香树精油处理人肝癌SMMC- 7721细胞24 h后诱导了肿瘤细胞的凋亡，表现为线粒体膜电位的下降。细胞外源死亡受体介导的凋亡主要的三条Fas/FasL、TRAIL和TNFR信号转导通路都需要Caspase8的活化。本研究中测定了连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞中Caspase8蛋白的影响，发现Caspase8蛋白水平相比对照组无显著上调，推测连香树精油没有通过外源死亡受体途径诱导人肝癌SMMC- 7721细胞凋亡。

细胞焦亡是近年来新的一种依赖于炎症小体半胱天冬酶- 1(Caspase- 1)的细胞死亡方式。Wei等[14]的研究表明半夏凝集素通过激活MAPKs/NF- κb通路释放IL- 1β，IL- 1β依赖于Caspase1发挥促炎作用。本研究中，通过测定连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞中Caspase1蛋白的水平发现Caspase1与对照组相比先下调后上升，无明显上调趋势，推测连香树精油没有诱导人肝癌SMMC- 7721细胞焦亡。

细胞自噬是细胞通过自噬溶酶体途径从而降解细胞内自身物质的过程，与细胞凋亡都属于细胞程序性死亡。二者间存在紧密的联系，主要表现为：第一，自噬和凋亡共同促进细胞死亡；第二，自噬与凋亡互为拮抗作用，自噬为肿瘤细胞提供生存所须的原料或ATP，抑制细胞凋亡；第三，自噬促进细胞向凋亡的转化[15]。Li等[16]的研究发现药用植物远志中的瓯黄酮诱导SKOV3和OVCAR3人卵巢癌细胞发生的自噬抑制了其诱导的凋亡作用；还有研究表明饥饿诱导K562/ADM白血病细胞发生保护性自噬，抑制其凋亡的发生[17]。本研究发现连香树精油诱导了人肝癌SMMC- 7721细胞自噬，推测自噬过程抑制了肿瘤细胞的凋亡作用。在加入自噬抑制剂后，Bcl- 2抗凋亡蛋白水平显著下调，促进了SMMC- 7721细胞的凋亡作用，表明连香树精油处理SMMC- 7721细胞后诱导的自噬作为一种保护机制存在，二者表现为拮抗作用。可以考虑通过抑制细胞的自噬过程来促进连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞的凋亡作用来杀死肿瘤细胞。

综上所述，连香树精油对人肝癌SMMC- 7721细胞具有显著的细胞毒性作用，显著降低了细胞活力并破坏细胞结构；通过阻滞部分G2/M期的细胞影响细胞周期；降低细胞中的线粒体膜电位诱导SMMC- 7721细胞发生凋亡。同时连香树精油能够强烈人肝癌SMMC- 7721细胞发生自噬，而自噬在精油诱导的细胞凋亡中作为一种保护机制存在。