三核苷酸重复序列的不稳定性在1型强直性肌营养不良中的作用

王子燚，孙 慧，李希希，霍龙文，王 猛综述，于雪凡审校

强直性肌营养不良1型(Myotonic dystrophy type 1,DM1)是一种常染色体显性遗传性神经肌肉疾病。其发病的核心机制是由于DM1蛋白激酶(DMPK)基因3’未翻译区域的胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(CTG)扩增所引起的转录RNA功能的改变，由此引起的下游事件导致一系列临床症状。该病由于具有极大的遗传变异性及临床异质性，因此给临床诊断与鉴别带来极大的困难。近年来，由于DM1患者具有遗传早现现象，CTG的重复次数不断扩大，在理解病理生理机制方面取得了巨大的进展。 DNA水平上三核苷酸重复序列的异常扩增成为DM1的导火索，本文综述了CTG重复序列的不稳定性以及CTG扩增与临床症状的关系，旨在阐述两者之间的内在联系。

1 CTG重复序列的不稳定性及相关机制

DMPK基因CTG重复扩增是导致DM1的致病突变，扩增的CTG重复序列的转录产生有毒的功能效应的CUG-RNA，从而导致疾病症状[1]。但驱动这种扩增的潜在突变尚未确定，有人推测DNA错配修复机制以及参与二级DNA结构的机制，如发夹结构或R-环，可能以某种形式参与其中[2]。DM1患者发病年龄从胎儿到中老年不等，并影响多组织系统。由于在DM1患者的精子和未成熟卵母细胞中已经存在CTG重复长度的变化，这表明CTG不稳定性主要发生在生殖细胞胚胎早期的有丝分裂期间[3]。DM1小鼠模型显示CTG扩张已经存在于精原细胞中，在7周龄的精子中就已经出现了对扩张的生发嵌合现象，此外CTG重复数目随着年龄的增长而继续增加且独立于减数分裂过程[4]。在妊娠第13～16 w，胚胎在组织中CTG数目变得不稳定且并随着时间的推移继续扩增，其中心脏、皮肤最为明显[5]。上世纪末，Southern blotting结果显示在不同组织中的CTG重复扩增高度不同，肌肉、心脏和睾丸中的CTG重复长度比血液、小脑和胸腺中的CTG重复长度更大[6]。由于DM1患者存在这种体细胞嵌合现象，因此很难通过患者体细胞的CTG重复数目来预测下一代。但是在DM1血液样本中，CTG重复长度的平均值随着时间的推移而增加，并且取决于重复序列的初始大小[6]。这表明重复的有丝分裂不稳定在整个生命中持续存在。扩张的程度与最初的重复大小相关。

2 错配修复途径在DM1中起到的关键作用

三核苷酸重复扩增不仅降低了DMPK基因所表达的蛋白或mRNA水平，还改变了相邻的染色质结构，减少了相邻基因的表达，如下游的SIX5基因和上游的DMWD基因[7]。最近假说提出，CTG重复序列周围的甲基化导致SIX5基因表达降低的原因，可能对精原细胞有害，从而阻止父系遗传后大量重复序列扩张的传播[8]。相反，当受影响的母亲携带从80到250个CTG重复序列的突变等位基因时，CTG数目不会受到甲基化的影响，从而在下一代会更大，因此先天性强直性肌营养不良往往来源于母系遗传[9]。由此可以发现DNA修复、复制、转录和表观遗传变化都会影响CTG重复不稳定的动态。每个过程可能以多种组合的方式参与，其有效性在不同的组织中可能有所不同，并可能导致的DM1患者之间的差异。

表观遗传学的改变被认为是DM1患者三联体重复不稳定和表型变异的修饰因素，其中甲基化修饰在DNA水平上起到了巨大作用，焦磷酸测序数据显示，DMPK基因内的DNA甲基化可以改善呼吸参数和肌肉力量，而与CTG重复长度无关[10]。几个DM1小鼠模型已证明错配修复途径在CTG重复不稳定动力学中的作用，其中MutSβ复合体(MSH2-MSH3)在CTG重复扩张的形成中至关重要[11]。MSH3作为错配修复基因，其表达是衡量三联体不稳定程度的一个重要参数，并被认为是这一过程中的一个限制因素。在DM1转基因小鼠中，MSH3是形成代际CTG扩增的限制因子[12]。此外，遗传关联分析表明，MSH3/DHFR3个串联重复等位基因，称为3a等位基因，可能会降低DM1患者的体细胞率，以及延迟发病[13]。不稳定性的水平是高度遗传的，这意味着不同的DM1个体存在特异性的反式遗传修饰的作用。识别这些反式作用的基因修饰物将有助于制定新的治疗方法，从而减少体细胞扩展的积累，并可能为这些因素在普通人群中癌症、衰老和遗传性疾病的发展中所起的作用提供线索。

3 CTG重复扩增数目的多少与临床异质性之间关联紧密

DMPK基因内扩展的CTG重复序列被转录成RNA但不被翻译，这些RNA与各种剪接调节因子形成聚集体，这反过来会损害多个基因在各种组织中的转录，从而影响下游各器官功能基因的表达[14]。一般说来CTG重复扩增较大的患者发病年龄较早，症状较重。国内外多家研究中心试图将CTG重复长度与症状严重程度、临床特征以及该病相关并发症联系起来。由于DM1患者的体细胞嵌合性，因此CTG与临床异质性之间关系大多以血清白细胞或研究的目的细胞中CTG数量含量为评价标准。重复次数较多的患者如果在最初检查时已经有症状，随着血液中的重复次数增加，在5 y内临床症状进展的可能性极大，也有部分DM1基因携带者可能会一直无症状，直到高龄。先前通过肌肉损伤评定量已验证对于DM1患者的核心症状(肌无力、肌强直以及活动耐力下降)与CTG重复扩增存在明显的正相关[15]。同样，CTG大小对于DM1患者多系统并发症亦存在极强的关联性。

3.1 CTG大小与中枢神经系统相关并发症 通过弥散加权呈像(Diffusion Tensor Imaging，DTI)可以发现CTG扩增明显的患者脑组织多部位各向异性分数(Fractional Anisotropy,FA)明显下降，提示CTG扩增程度越高，FA所呈现的纤维组织受损越重[16]。DM1患者包括双侧眶额叶、额叶前部、岛叶、外囊和枕叶皮质在内的广泛区域内的弥散度指标下降。此外，厚度与这些区域的CTG重复数呈负相关。DM1患者的皮质脊髓束(CST)中的DTI参数与遗传因素和运动性能之间存在显著的关系。这些发现提示CST的介入反映了运动束的恶化，可能在临床肌强直中起重要作用。此外，皮质灰质体积与CST中DTI测量值之间的直接关系表明，CST中白质异常与DM1患者感觉运动皮质的体积减少密切相关[17]。同时，灰质和白质的完整性与CTG重复序列相关，但CTG重复序列大小与脑结构改变之间的关系尚未得到证实，亦有一些相互矛盾的研究。DM1患者在社会认知及情绪调节方面存在明显障碍,已经证明这些高级功能障碍与大脑结构和功能障碍密不可分。部分患者对自己的症状漠不关心，这也是由于DM1导致的认知能力下降所致。在IQ分数和CTG重复的大小之间没有统计学上显著的相关性。DM1与广泛分布的灰质和白质网络变化有关。一些与认知相关的区域与CTG重复显著相关[18],由于大脑由高度专业化的功能区组成，因此与CTG重复大小有关的区域信息将具有重要的临床意义。

3.2 CTG大小与心血管系统相关并发症 虽然CTG重复扩增引起多系统受累，但患者的主要死亡原因是肌肉萎缩和心脏性猝死。过三分之二的DM1患者经历严重的心脏功能障碍，包括心脏传导延迟、致命的窦房和房室传导阻滞、心房颤动和室性心律失常[19]。对于CTG重复大小作为传导障碍或心脏事件的预测指标是否有价值，目前文献存在较多分歧，尚无法达到统一共识。CTG 数量大小是否可以循环系统障碍的并发症的预测因素仍然需要大样本进行统计。近日相关研究发现，在DM1心脏组织中，CTG扩增引起的RNA结合蛋白RBFOX2的非肌肉剪接异构体上调是导致了DM1个体的心脏传导缺陷的重要因素。RBFOX240上调的程度与CTG重复扩增的大小亦是当下重点研究方向[20]。这就意味着修饰基因以及错配修复机制在DNA水平上对CTG的影响起到了至关重要的作用。

3.3 CTG大小与呼吸系统相关并发症 DM1患者较其他患者更早出现呼吸功能不全。Salvatore等人通过对268名DM1患者进行多中心横断面研究发现白细胞CTG扩张大小与呼吸肌受累的大部分功能参数、劳力性呼吸困难显著相关，且证实CTG是DM1患者呼吸受限的独立预测因子[21]。对于DM1患者，睡眠中的呼吸障碍更为常见，日间睡眠亢进，伴有睡眠潜伏期短，入睡时眼球运动迅速，下丘脑下泌乳素系统异常这些均可能归因于睡眠呼吸暂停[22]。在慢性呼吸功能不全的主观症状中，只有疲劳性呼吸困难与限制性模式显著相关，这是由于呼吸困难不仅仅是由于肺部功能损害，骨骼肌无力也是其主要原因，这与DM1中的特征密切相关，而CTG作为二者共同的预测因素，其在临床工作中具有评价预后的价值。

3.4 CTG大小与眼部相关并发症 白内障、上睑下垂、眼动异常和低眼压是DM1中最公认的眼部问题，其中前三者与运动功能障碍有关。眼压降低也很常见，但似乎与运动障碍无关[23]。与DM1相关的晶状体混浊似乎具有完全的遗传性，也就是说，近100%的DM1患者存在白内障[24]。即使特别小的CTG重复序列也会引起眼部症状的发生，而且其严重程度会随着病程的进展而加重，因此两者之间的关系则显得扑朔迷离。一项对于韩国DM1患者眼部研究结果表明CTG>700的DM1患者行白内障摘除的几率远高于<700的患者，即两者呈正相关[25]，但这需要更大规模的研究来证实。

除了上述并发症以外，DM1患者恶性肿瘤的风险也有所增加，患癌症的风险增加了约一倍，最常见的有皮肤癌、甲状腺癌和乳房癌等[26]。消化功能障碍、内分泌紊乱、周围神经病和其他发育和退化表现也是DM1患者的常见表现，其与CTG的重复数目之间的关系由于原始研究的不足，因此尚无定论。

4 总结与展望

自从发现DM1的CTG重复序列的不稳定性以来，CTG重复序列扩张的动力学及其与疾病的各个方面的关系方面均取得了相当大的进展。统计学的发展使人们有可能改进重复序列的大小和临床症状之间的相关性，并揭示了DM1中明显的一些变异性。RNA的毒性作用起源于DM患者DMPK基因的非编码区的CTG重复扩增，导致在S期复制叉停滞，以及细胞应激反应[27]。因此致病过程在DNA重复扩增阶段最为简单也最好把控，无需针对下游再行过多干预。对于DM1患者，药物作用的等位基因只有一个，所以理论上用药的种类以及浓度都应少于作用于特定的下游途径。因此在DNA水平上的如果能够减少GTC扩增数量则可获得最有效的治疗效果，但在技术上存在相当大的难度。随着CRISPR/Cas9基因编辑平台的广泛应用[28]，DM1的基因治疗手段也逐渐被完善，从而使得遗传学和修饰物的鉴定取得进展，这将有助于在未来的临床试验中对患者进行分层与治疗。因此对于DM1患者的三核苷酸重复序列的不稳定性来说，更好地了解这种变异性的来源对于开发新的具有挑战性的疗法非常重要，特别是对于在个性化治疗的道路上有重大意义。