血小板微粒与缺血性脑卒中诊疗的研究进展

李庆运，曾俊玲 综述 陈煜森 审校

广东医科大学附属医院神经内科，广东 湛江 524001

脑血管疾病是危害人类生命和健康的疾病谱中最重要的疾病之一。全球每年约有1 500万患者被诊断为中风，其中约有500万人死亡，是全球第二致死病因，也是长期致残重要病因[1]，在中国每年约240 万人患有脑卒中，约有110 万人死亡[2]，这已成为中国人民主要死因，而缺血性脑卒中(Ischemic stroke，IS)占其80%左右[3]。目前缺血性脑卒中患者，能在短时间内迅速恢复脑血流，挽救缺血半暗带的有效治疗方法是超急性期溶栓与血管介入治疗，但由于其时间窗极短与禁忌证较多，能在临床运用并使患者收益相当少，导致IS 患者往往具有很高的残疾率和死亡率。因此寻找IS早期诊断、判断预后的新的标记物和新的治疗方法已成为神经科学领域的研究热点之一。越来越多研究表明：血小板微粒(platelet microparticle，PMP)不仅有望成为判断IS严重程度及预后新的标志物，而且有望为IS患者治疗方面提供新的治疗思路。

1 血小板微粒概述

血小板微粒首次被发现是在1967年，当时发现者沃尔夫将它们命名为“血小板尘埃”[4]。经后面研究表明，血小板微粒是血小板在应激后通过血小板激活和自身凋亡两条途径释放的直径在0.1～1.0 um的颗粒样物质[5]。血小板微粒是循环微粒中含量最丰富的微粒，占70%～90%[6]。血小板微粒释放受高剪切力[7]、ADP、细胞因子、低温、凝血酶[8]、胶原[9]、Ca2+[10]、补体[11]等影响。有研究通过对比不同血小板激动剂作用下产生的血小板微粒，经过蛋白组学检测显示，PMP 中的蛋白质组成与用于血小板刺激的激动剂类型直接相关[12]。

目前PMP的形成和释放机制研究尚未明确，普遍认为血小板活化时，通过细胞膜信号转导、钙通道开放、钙离子动员和细胞内钙浓度升高，蛋白质磷酸化，细胞骨架被破坏，这些机制与PMP形成与释放关系密切。当血小板被激活时，细胞内钙浓度增加，位于细胞骨架中的肌球蛋白形成细丝，然后从细胞的外围收缩到中心，而位于膜骨架的肌动蛋白微丝由于受依赖凝Ca2+胶蛋白切割，使其聚合受阻。当活化血小板收缩时，部分缺乏正常膜骨架支持的细胞膜不能正常收缩，向外伸展变形形成伪足，而正常膜骨架支撑部分向内收缩，伪足末端具有芽状凸起。最后这些活化血小板形成的变形细胞膜可以通过伪足破裂或芽状突起出芽形成PMP。

有研究发现，在无传统钙蛋白酶激活的情况下，静息血小板形成可通过整合素αIIbβ3信号传导引起肌动蛋白细胞骨架的去稳定化。这种由整合素介导的肌动蛋白细胞骨架的不稳定而导致PMP的形成，这种不依赖Ca2+的传统模式，可能是血小板凋亡有关[13]。血小板凋亡可释放PMP，而导致血小板凋亡机制有两种，一是由细胞表面死亡受体(肿瘤坏死因子受体等)诱发，经过受体与配体相互作用，传导信息，引起半胱天冬酶原自身切割，最后导致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活化，促使血小板凋亡[14]，这是外源途径。二是线粒体受细胞内信号刺激，使其内膜去极化，打开通透性转换孔，膜间隙释放细胞色素C，最后由凋亡执行蛋白诱导血小板凋亡，这是内源性途径。

2 PMP在IS中的病理生理机制

2.1 PMP与炎性反应 目前PMP参与炎症反应机制仍未明确，普遍认为内皮细胞、单核细胞可以被PMP活化，并促进两者相互作用。而活化单核细胞可通过分泌多种促炎因子如肿瘤坏死因子-α、黏附分子、蛋白水解酶、白细胞介素-1β等，使内皮细胞受损，诱导脑内皮细胞黏附分子表达，损害血-脑脊液屏障。中性粒细胞通过受损的血-脑脊液屏障，在缺血性脑组织黏附聚集，通过产生蛋白分解酶和氧自由基，调节炎症反应，使脑组织受损。然而有人提出PMP可能通过稳定Treg表型，调节炎症反应从而在组织修复过程发挥作用[15]。调节性T细胞(Tregs)与人体自身免疫息息相关。当Tregs受外来刺激后可自身调节可表现出对促炎症表型的可塑性，进一步分泌白细胞介素-17(IL-17)或干扰素-γ(IFN-γ)。Tregs 表型是否稳定与炎症反应是否持续密切相关，当其失衡时可引起移植物抗宿主病。PMP 能通过与CCR6 +HLA-DR+记忆样Treg亚群、P-选择素、CXCR3结合成剂量依赖性抑制外周血衍生的Tregs 分化为产生IL-17和IFN-γ的细胞，稳定Treg表型，抑制炎症反应，缩短炎症持续时间，从而可能促进脑组织恢复。

2.2 PMP 与血栓形成 血小板微粒促进血栓形成主要机制有以下三个方面，一是血小板活化因子(PAF)方面，PAF是血小板激活剂[16]。当PAF浓度达到一定水平时，就易诱发血栓形成，而PMP 决定了PAF的活性。二是PMP 膜富含PS，当血小板活化时促进血小板聚集和凝血反应，同时它可以通过释放PMP表达PS 或TF，导致更多凝血酶释放，使凝血反应加强。这是一种类似于正反馈机制，通过这正反馈加强凝血反应，最终导致血小板进一步减少和血液高凝状态形成[17]。这种正反馈作用在临床多种疾病血栓形成中起重要作用，进一步剖析该途径，研究拮抗剂或许能成为新一代的抗栓药物。有研究通过对比PMP 与活化后血小板单位表面积在促凝血方面活性发现，PMP促凝血活性远远高于活化血小板，最高可达到活化血小板的100 倍[18]。三是Ⅷ因子和Va 因子，Ⅷ因子是Tenase 酶复物形成的协同因子；而凝血酶原酶复合物形成取决于因子Va与Xa结合。虽然Ⅷ因子与血小板的联系不稳定，但Ⅷ因子及Va 因子结合到PMP 的表面时是稳定的，因此PMP在这方面不依赖于血小板活化促进凝血，这种促凝血活性比血小板活化引起的凝血更持久。据报道SPMP(直径小于0.5 μm 的血小板微粒)可触发血小板和单核细胞功能，并通过P-选择蛋白调节血栓形成[19]。

2.3 PMP 与血管新生 PMP 促进血管新生主要是因为PMP 包含多种血管生成mRNA 及多种原型血管生成蛋白，例如表皮生长因子、血小板衍生生长因子-α、成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子、内皮糖蛋白、内皮素-1、五聚蛋白-3、血小板因子-4、纤溶酶原激活物抑制剂-1、血管生成素-1、组织金属蛋白酶-1 和血小板反应蛋白-1 的抑制剂[20]。从而促进血管生成。有研究发现，PMP 可将微RNA(miRNA)传递至受体细胞，改变了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中血管生成调节剂的释放，还可以抑制血小板反应蛋白-1的生成[21]，从而调节血管形成。此外还有研究发现，PMP 可以通过促进低氧诱导因子-1α细胞分泌血管内皮生长因子，从而促进血管新生[22]。动物实验表明，大鼠大脑中动脉闭塞实验模型中，PMP可导致梗死边缘区细胞增殖、血管生成呈剂量依赖性增加，行为缺陷明显改善[23]。而在后肢缺血的啮齿动物模型中，静脉注射PMP也可促进新血管形成[24]。

3 PMP有望成为IS早期诊断与预测预后的标志物

CHEN 等[25]发现，外周血中检测PMP，急性缺血性脑卒中(AIS)患者较健康志愿者的PMP 水平显著升高，而且AIS亚型中循环PMP的水平与梗死体积呈正相关，在小动脉闭塞(LAA)亚型中更明显。既往也有研究表明，脑梗塞面积与患者良好临床预后呈负相关，梗塞面积越大，并发症越多，神经修复能力越低[26-28]。此外，动脉粥样硬化性脑梗死的PMP水平明显高于心源性脑梗死[29]。而颈动脉粥样硬化患者血浆中的PMP水平明显高于无颈动脉粥样硬化的健康人。这些研究表明PMP 不仅有助于诊断是否患有缺血性脑卒中及判断缺血性脑损伤程度，而且在鉴别脑梗塞病因方面也有一定潜力。甚至PMP 在成为动脉粥样硬化的标志物方面也有巨大前景。

目前AIS 患者最有效治疗方法是，在时间窗内静脉溶栓与血管内治疗。对决定是否进一步血管内治疗取决于静脉溶栓是否再通情况，在短短的治疗时间窗内，快速、简捷的判断再通情况的标志物尤为重要。BIVARD等[30]纳入57例诊断为急性脑梗塞并在溶栓时间窗内患者，在接受静脉内rtPA治疗后局部或完全再通的缺血性卒中患者与再通状况较差的患者相比，PMP 的水平显着增加，因此PMP 可能是再灌注治疗有效性的生物标志物。而再通是临床预后的有力预测指标，PMP的水平不仅有望成为预测溶栓患者预后指标，而且有望成为静脉内治疗的再通标记为溶栓患者是否分流至血管内治疗临床提供有效的指导。

目前有研究通过纳入42 例症状性颈动脉疾病患者和31例健康人对照，探讨了症状性颈动脉疾病患者PMP水平与后续复发栓塞事件标志物之间的关系，发现症状性颈动脉疾病患者急性脑缺血病变(DWI+)的PMP较对照组升高，而症状性颈动脉疾病患者中急性脑缺血病变(影像学DWI+)较(影像学DWI-)患者PMP明显升高[31]。该研究与既往研究PMP 与近期脑缺血事件具有相关性结果相符。值得注意的是，经颅多普勒超声(微栓塞信号)是提示正在进行血栓栓塞活动，而此实验中经颅多普勒超声(微栓塞信号[MES+])患者较微栓塞信号[MES-]患者PMP 也明显升高，PMP与正在进行血栓栓塞活动相关。此研究表明PMP 可以预测正在进行的血栓栓塞活动。

4 PMP与缺血性脑卒中的治疗

4.1 PMP 有望成为缺血性脑卒中新的治疗方法 通过健康志愿者中收集获得PMP，予以不同浓度PMP浸润缺血性脑梗塞模型大鼠脑表面，通过追踪大鼠脑卒中后90 d 内，神经功能缺损评定、免疫组织化学等检测发现，外源性PMP处理后的大鼠较未处理大鼠梗塞边界血管、新生细胞数量明显增加，残疾评分下降更明显[23]。PMP 在体内以剂量依赖的方式增加血管生成和神经发生，并改善中风后的功能结局。或许在重症脑梗塞，如大面积脑梗塞，尤其是去颅瓣减压患者方面，可予以外源性PMP 浸润，促进IS 患者血管新生、神经干细胞分化，促进患者神经功能缺损症状改善，这或许有望成为缺血性脑卒中治疗新方法，当然目前研究较少，PMP对缺血性脑卒中恢复期作用还需更多证据，运用于临床还有很长一段路要走。

4.2 抗血小板治疗与PMP释放

4.2.1 不可逆的环氧合酶抑制剂 抗血小板药对于血管疾病的预防和治疗尤为重要，但是它们对PMP释放的影响及机制目前尚未明确。乙酰水杨酸，也称为阿司匹林，是一种环氧酶抑制剂。目前关于PMP对乙酰水杨酸(ASA)治疗的反应性的报道是有限且矛盾的。既往研究发现，ASA 可降低健康受试者[22]、高血压心脏病、非重度(＜50%管腔狭窄)冠状动脉疾病的患者的PMP产生[33]。在心肌梗塞模型大鼠实验中，ASA也可降低PMP 水平。同时相对于单用ASA 相比，双抗(ASA 联合氯吡格雷)效果更为明显。尽管如此，绝大多数报告表明ASA 对PMP 形成的影响有限。ASA对IS 的急性期或慢性期患者、房颤、周围动脉闭塞性疾病、高脂血症患者、多发性梗塞性痴呆症患者、急性冠脉综合征、1 型或者2 型糖尿病患者PMP 的释放均无明显影响[34-40]。这些矛盾的实验报道可能是ASA不同治疗时间、ASA剂量、PMP定量方法等不同引起，现需进一步规范化及大样本研究证明。有必要进一步研究不同剂量下ASA 或联合抗血小板治疗能否减少PMP释放。

4.2.2 腺苷二磷酸受体抑制剂 P2Y12 ADP 受体通过与Gi 蛋白和腺苷酸环化酶途径偶联，相互作用，促进纤维蛋白原的GP IIb/IIIa受体激活，这在PMP形成中起重要作用[41]。P2Y12受体拮抗剂通过增加环内单磷酸腺苷的血小板内浓度，降低血小板激活敏感度和随后的血小板囊泡化。有研究发现急性冠状动脉综合征患者在发病24 h内[42]，予以氯吡格雷治疗，通过检测用药前后循环PMP表达水平发现，PMP在服药后下降，其中以持续用药第5 天最为明显。FRANÇA等[43]也发现，稳定的冠心病患者氯吡格雷血浆浓度与PMP 释放量成负相关。PMP 或许可以成为评估药物抗血小板效果的潜在标志物。

4.2.3 HMG-CoA 还原酶抑制剂(他汀类) 血小板活化和聚集能促进凝血反应和血栓形成。据此，通过抑制血小板活化，启动IS一级预防，或许是预防IS的有效方法。有研究发现HMG-CoA还原酶抑制剂，不仅可以通过降低胆固醇，减少动脉粥样硬化事件[44]。同时可以预防内膜增生及血小板的活化和聚集。参与细胞骨架重组的修饰G 蛋白功能和Rho 激酶途径，他汀类药物会影响PMP脱落，以脂质非依赖性方式降低PMP的数量[45-46]。HMG-CoA 还原酶抑制剂有助于降低NF-KB活性，并促进过氧化物酶体增殖物激活受体暴露。因此，它们影响许多促炎细胞因子和趋化因子的释放[47]，从而限制了血小板的活化。ROSA等[45]研究结果也相同，与未经治疗的血浆脂质水平相同的患者相比，他汀类治疗的高胆固醇血症患者的PMP浓度较低。缺血性脑卒中后高脂血症患者予以辛伐他汀20 mg/d，维持6个月，患者PMP百分比降低[48]。

4.2.4 维生素K 拮抗剂 CHOUDHURY 等[49]通过对房颤(AF)患者治疗研究，发现以前未进行过任何抗栓治疗，华法林开始口服抗凝治疗(国际标准化比例的目标范围在2～3)对PMP 释放没有显著影响，而且，在接受ASA 和华法林的AF 患者中，PMP 浓度无显着差异。既往规律服用ASA 的AF 患者改为服用华法林一段时间对比，PMP释放也没有明显变化。

5 展望

综上所述，PMP 具有多种特性，在缺血性脑卒中中参与多种病理机制，PMP 在成为缺血性脑卒中诊断、预后的标志物，提供新的治疗思路具有巨大潜力。研究人员已开始将PMP视为血管疾病(尤其是脑血管疾病风险分层)中的新型生物标记物。药物对循环PMP的影响，或许可以为IS治疗的提供一个新的治疗方向。通过调节PMP释放，而且暴露其表面标志物可能具有重要的治疗作用，同时可能监测抗血小板治疗的疗效。虽然PMP在缺血性脑卒中的早期诊断、治疗及预测预后方面具有广阔前景，但是距离运用于临床还有很长一段路要走，还需进一步研究和检验。