p38MAPK通路在脑缺血再灌注损伤中的研究进展

翁雨天 黄 茜 杨旭娟 刘国光 刘一丹△

1)昆明医科大学，云南 昆明 650500 2)昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650100

脑卒中是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病。脑卒中是我国成年人致死致残的首位病因，也是我国疾病致寿命损失的首位病因。目前最有效的治疗手段是溶栓，但溶栓后脑组织在缺血情况下恢复供血，加重损伤脑组织，病情进一步恶化，这种病理现象被称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。CIRI的病理机制比较广泛，主要包括氧化应激、炎性因子、NO大量合成、MMP-9表达上调、神经细胞凋亡等[1]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)主要介导生理病理刺激，如细胞因子、神经递质、激素、缺糖、缺氧等进而作出不同反应[2]。丝裂原活化的蛋白激酶级联反应由至少三种激酶组成：MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK或MKK)和MAPK。这些酶在所有真核生物中都是高度保守的，在各种发育和生理过程中都起着至关重要的作用。MAPK可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和ERK5[3]。p38MAPK通路是MAPK通路的重要组成部分，调节细胞核相关基因的转录，介导了细胞炎症、侵袭、凋亡、分化等重要的生理过程。GONG等[4]研究发现p38MAPK通路介导炎症、氧化应激、细胞凋亡在CIRI整个病理进程中发挥着重要的作用。为了进一步深入了解p38MAPK通路与CIRI病理机制的关系，本文对p38MAPK通路在CIRI中的作用进行综述，旨在为预防及治疗CIRI提供一定的理论基础。

1 p38MAPK的结构与生物学特性

p38是由360个氨基酸残基组成的相对分子质量为38 000的钙结合蛋白。p38通路由MAPKKK、MAPKK、MAPK组成，MAPKKK包括MEKK1至4(MEKK1-4)，MLK2和MLK3，DLK，ASK1和Tak1；MAPKK包括MEK3和MEK6；MAPK包括p38α、p38β、p38γ和p38δ同工型。其在氨基酸水平上具有高度的序列同源性(同工型之间>60%的同一性)。p38αMAPK在许多细胞类型中普遍表达，相反p38βMAPK在脑和肺中表达较高，p38γMAPK主要富集在骨骼肌和神经系统，而p38δMAPK在子宫和胰腺中高表达[5]。所有同工型均具有相同的保守结构域(从Ⅰ到Ⅹ)和Thr-Gly-Tyr(TGY)双磷酸化基序，通过TGY基序的靶向磷酸化被上游激酶(MAPKK)激活[6]。磷酸化的TGY基序和激活环的长度被确定为不同于其他两个MAPK分支的成员，即细胞外信号调节激酶(ERK)和c-jun N末端激酶(JNK)。这种独特的特征可能赋予每个MAPK亚家族底物特异性[7]。

磷酸化的p38MAPK在胞质中，激活蛋白激酶，调节生理活动；进入核内，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达。当细胞受到刺激后，通过高度保守且较复杂的三级激酶“级联”程序转导信号[8]，逐级磷酸化，调控基因的转录和表达，参与了细胞增殖、分化、应激和凋亡等多种细胞反应[9]。

2 p38MAPK在脑缺血再灌注损伤中的作用

2.1改善氧化应激损氧化应激损伤是脑缺血再灌注损伤的重要生理病理机制之一。环氧化酶-2 (cyclooxyge-nase2，COX-2)是催化花生四烯酸(arachidonic acid，AA) 生成前列腺素(prostaglandin，PG) 的限速酶。脑缺血再灌注时脑组织AA在COX-2催化作用下生成大量氧自由基。氧自由基可以引起DNA损伤及形成脂质过氧化物等机制而产生细胞毒性[10]。超氧离子与一氧化氮形成氧化能力更强的过氧亚硝基，引起脑组织损伤。p38MAPK通路在氧化应激反应过程中扮演着重要角色。PIAO等[11]在大鼠的脑缺血再灌注实验中发现，缺血性半球中的COX-2的表达增加，使用了p38MAPK通路抑制剂SB203580后，COX-2 mRNA的表达明显下降，说明通过p38MAPK通路可以调节COX-2的表达。NAVARRETE等[12]实验发现NADA可明显诱导脑血管细胞中COX-2 mRNA表达的上调和磷酸化p38MAPK，而p38MAPK通路抑制剂SB203580能够阻止COX-2蛋白的上调，实验表明NADA激活p38MAPK通路来调节COX-2 mRNA的表达从而诱导了轻度的脑血管细胞氧化应激。HOU等[13]在抗氧化剂CA研究中发现，缺血再灌注增加了COX-2的表达，而CA抑制低氧刺激脂质过氧化，抑制了缺氧激活的COX-2信号通路，增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低了PGE2的产生。在实验中发现CA剂量依赖性地降低COX-2的表达，而磷酸化p38MAPK表达也在下降。CA的保护作用可能是通过抑制p38MAPK通路的激活从而降低COX-2的表达保护细胞。

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)分为3种类型：内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)。活化的eNOS和nNOS仅产生少量NO，而iNOS的活化受多种因素调控。SATO等[14]研究发现iNOS活化后可诱导产生大约1 000倍的eNOS和nNOS生成NO量的总和。过量的NO具有毒性作用，与超氧离子形成氧化能力更强的过氧亚硝基，引起脑组织损伤。CHENG等[15]发现在脑缺血再灌注后，缺血皮层中nNOS、iNOS、NO和磷酸化-p38 MAP激酶水平均显着增加，使用Ferulic acid可以抑制NO、nNOS、iNOS、磷酸化-p38 MAP激酶的水平的升高。在实验中发现抑制p38 MAP激酶介导的NO途径可以保护神经细胞的凋亡。Ferulic acid可能通过抑制p38MAPK磷酸化抑制NO的大量生成从而保护神经细胞。CHEN等[16]在厚朴酚研究中发现脑缺血再灌注损伤会诱导氧化应激，从而导致产生一氧化氮(NO)，蛋白质亚硝化的介体，以及其他活性氧(ROS)，改变了细胞氧化还原依赖性反应，并影响了蛋白质的错误折叠。厚朴酚通过p38MAPK失活而发生的途径和降低CHOP的蛋白质水平，从而减少iNOS的诱导和产物的产生来抑制缺血再灌注引起的大鼠神经元损伤。多种模型研究发现，p38MAPK通路在减轻细胞、组织、器官的氧化应激中发挥着重要作用。

2.2减轻炎性机制损伤炎性机制损伤是脑缺血再灌注损伤的重要生理病理机制之一。炎症反应涉及到许多炎症细胞和炎性介质，例如白细胞、胶质细胞、白细胞介素-1(interleukin，IL-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等[17]。脑缺血再灌注后炎性细胞因子的过度表达和炎性细胞浸润，加重脑组织损伤[18]。白细胞介导脑缺血再灌注损伤的机制：阻塞微小血管，造成血管栓塞，释放炎症因子，增加血管通透性引发脑水肿，出血等[19]。小胶质细胞在CIRI中具有双重作用：一方面吞噬坏死细胞碎片，分泌神经营养因子，调节神经组织的再生和重建；一方面分泌大量的炎症因子和炎症介质，引起神经元损伤和血脑屏障破坏[20]。星形胶质细胞能诱导小胶质细胞分化、增殖，增强小胶质细胞和巨噬细胞的吞噬能力；诱导产生大量炎症介质，造成脑组织损伤[21]。JIANG等[22]发现Bilobalide对脑神经元的有保护作用。OGD/R大鼠脑缺血再灌注中p38MAPK蛋白的磷酸化显着增加。Bilobalide抑制p38MAPK活化，降低了炎症介质的产生。在实验中发现磷酸化的p38MAPK可以磷酸化调节Hsp-27的MAP激酶AP-2和MAP激酶AP-3，增加促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达，诱导炎性级联反应，并增加神经元细胞损伤。Bilobalide通过抑制p38MAPK磷酸化来抑制炎症介质的产生从而减少神经元细胞的死亡。SONG等[23]研究发现MCAO后观察到皮层中p38MAPK激活，继而激活诸如TNF-α和IL-1b的细胞因子，从而增加血脑屏障的通透性。研究[24]发现MAPKs信号通路调节脑缺血再灌注损伤中炎症基因的转录。p38MAPK被认为是应激诱导的激酶，这些激酶与细胞因子释放和凋亡的调节有关。脑缺血再灌注损伤增加了p65的磷酸化，并促进了其内源性抑制剂IκBα的降解。与脑中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的下调相一致，在NOD2缺陷小鼠中MAPKs的激活被显著抑制。越来越多的证据表明，抑制MAPKs有助于抑制神经炎症，p38MAPK已被鉴定为神经炎症信号通路中的特异性标记[25]。p38MAPK的抑制，在脑缺血再灌注损伤后中导致炎性细胞的减少，从而减少炎症介质的释放。研究发现WT小鼠脑CIRI损伤后MAPKs被激活，而NOD2缺乏显著抑制p38MAPK的激活[26]。p38MAPK通路在CIRI炎症免疫应答中发挥着重要作用，为CIRI临床预防和治疗提供了一种新的方向。

2.3调控MMP-9蛋白表达基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一组Ca2+、Zn2+依赖性蛋白酶。MMPs家族已分离鉴别出二十余种，根据结构与底物的特异性，MMPs大致分为6类。MMP-9属于明胶酶，主要功能是降解和重塑造细胞外基质(ECM)[27]。在正常生理条件下，参与血管新生、胚胎形成、创伤愈合；在病理状态下，活化的MMP-9可以通过激活纤溶酶原作用于基底膜 (ECM) 成分，通过降解脑血管周围基膜主要成分Ⅳ型明胶原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白，导致脑微血管结构完整性破坏和血脑屏障破坏[28]。QIN等[29]研究发现脑缺血再灌注损伤后MMP-9表达增加，salvianolic acid B (SalB) 给药组的脑组织MMP-9表达明显减少。NO通过鸟苷酸环化酶以及cGMP水平对MMP-9活性起到重要调节作用。salvianolic acid B能明显抑制诱导型一氧化氮合酶NOS2的表达，从而减少MMP-9的表达。在多种细胞和刺激条件下，p38蛋白是NOS2表达所必需的调节因子。脑缺血再灌注损伤以后，脑组织p-p38含量明显增加，salvianolic acid B可以明显抑制p-p38的表达。salvianolic acid B可能通过p38MAPK通路抑制MMP-9的表达。DONG等[30]研究发现脑缺血再灌注损伤中pentoxifylline显著降低了MMP-9蛋白和p-p38蛋白的表达。pentoxifylline通过抑制NOS的表达水平，从而降低MMP-9蛋白的表达。p38MAPK途径的可以调节一氧化氮的表达水平。pentoxifylline可能通过抑制p38MAPK的表达从而降低MMP-9的表达来保护神经血管单元。TGF-β是一种多能细胞因子，参与许多神经血管单元的生理和病理学过程。TAKAHASHI等[31]研究发现TGF-β1处理脑细胞后，培养基中MMP-2和MMP-9呈浓度依赖方式显着增加；而使用p38 MAP激酶抑制剂SB203580抑制了TGF-β1对MMP-9上调的作用；使用TGF-β受体抑制剂SB431542阻断了TGF-β1诱导的p38 MAP激酶的磷酸化，表明转化生长因子-β1(TGF-β1)可能通过p38丝裂原活化蛋白(MAP)激酶信号传导诱导脑细胞中的MMP-9上调。动物模型中发现MMP-9与CIRI病理机制密切相关，p39MAPK通路与MMP-9蛋白还有待进一步研究。

2.4减少细胞凋亡细胞凋亡是指在生理病理的刺激下，基因调控细胞有序的死亡。以往认为凋亡是机体对环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程，但不正常的细胞凋亡则是一种病理现象。CIRI神经元凋亡机制有以下几点：(1)生理病理因素刺激；(2)钙超载[32]；(3)神经元氧化损伤诱导凋亡的发生；(4)线粒体损伤[33]；(5)凋亡有关的细胞因子。SU等[34]于研究UCF-101治疗的分子机制中发现，在脑缺血再灌注损伤的大鼠模型中UCF-101具有减轻脑缺血再灌注损伤并减少凋亡神经元的作用。UCF-101的特定抑制剂Omi/HtrA2显著降低p-p38表达水平，显著抑制caspase 3/9的活性表明UCF-101可能通过抑制p38MAPK的激活来抑制细胞凋亡，从而保护神经细胞。JIE等[35]研究发现在中脑动脉阻塞(MCAO)小鼠模型中，TRPV4的蛋白质水平会随着持续的再灌注而增加。注射TRPV4激动剂GSK的小鼠中p-p38MAPK的蛋白质水平显著增加，Bcl-2/Bax蛋白比率的显著增加。注射p38MAPK拮抗剂显著减弱了注射GSK的小鼠中Bcl-2/Bax蛋白比率的降低和casapse-3蛋白裂解的水平的升高。实验表明TRPV4的过度激活增强p38MAPK信号通路，使Bcl-2/Bax蛋白比值负向移动并最终激活caspase-3，最终诱导细胞凋亡。p38MAPK通路在细胞凋亡方面发挥着重要作用，降低细胞凋亡，保护神经细胞，为临床预防治疗提供一种新的策略[36]。

本文基于目前研究现状对p38MAPK在CIRI中的关系进行了综述，但对目前p38MAPK与CIRI中的具体联系还未完全阐明。p38MAPK是MAPK 家族中重要的成员，其在细胞凋亡、侵袭、炎症、缺血再灌注损伤等方面均发挥重要作用。脑缺血再灌注损伤机制的研究对于血脑屏障的保护有重要临床意义，亦是近年来的研究热点，目前在这方面的成果寥寥无几，能够对临床具有指导意义的更是甚少。p38MAPK在脑缺血再灌注的发生以及过程均发挥了重要作用，对p38MAPK在脑缺血再灌注作用及机制的不断研究，可能为脑缺血再灌注的临床防治提供一个新的方向。