心肌细胞再生基础研究与中医药探索

史建伟，惠逸帆，蒋宝平，李建萍，余 黎

心脏损伤基本功能与结构单位发生改变并伴随心肌细胞损害、流失、凋亡甚至坏死。临床通过β受体阻滞剂等药物及经皮冠状动脉支架植入术、冠状动脉搭桥术等方式延缓损伤、恢复正常血供是主要治疗方法。中医学认为这类疾病是由于心失所养、心气不足、气滞血瘀、心脉痹阻直至心阳亏虚，从而引起“心悸”“胸痹”“心衰”等各类心系疾病。临床治疗采用补益心肺、活血化瘀、益气温阳利水方法调畅气血保护心脏。关于心肌细胞再生途径、改善心脏病预后是这类疾病研究的热点和难点，现综述心肌细胞再生的研究现状及相关动物模型，并探讨中医药在心肌细胞再生的应用和可能发挥的作用。

1 心肌细胞再生的可行性

传统理论认为，心肌细胞在人类与大部分哺乳动物成年后处于终末分化状态，无法对损伤进行自我修复。有研究表明心肌细胞再生有可能实现，包括人类在内的哺乳动物心脏在正常衰老与疾病进程的损伤中具有一定程度的再生能力[1]。由于14C可结合分裂细胞DNA，有研究利用核爆后大气中产生的14C整合至植物内，被人类以食物链方式摄入，跟踪标记14C的DNA，在检测尸体中14C标记的心肌细胞后发现，人类心肌细胞自我更新率随年龄递减，一生中再生的心肌达45%，体现了人类心肌自我更新的巨大潜能[2]。Ieda等[3]通过心脏转录因子组合GMT(Gat、Mef2c与Tbx5)共转染成功使心脏和皮肤中成纤维细胞重新分化为心肌细胞。有关新生儿心肌梗死[4]与胎儿心脏矫正手术[5]研究表明，新生儿心脏损伤后可实现功能性恢复并具有较高的再生潜能。人类心肌细胞的分化再生并非难以实现，在年龄与外界因素等影响下导致其生长更新速度相对缓慢，短期难以弥补心肌损伤导致的心功能不全，但在某些疾病的长期康复过程中具有现实意义。除再生进程缓慢外，纤维化、过度炎症反应和血管再生不足是再生过程的三大障碍[6]。

2 心肌再生的常用动物模型

通过生物模型模拟人类心脏功能是可行的方法，其过程需综合考虑动物来源、价格、操作、实验要求及与人类心肌分化生长方式相仿程度等因素。以心肌细胞坏死为主要病理表现的心肌梗死为例，大鼠是相关研究中应用最广泛的动物模型，其次是兔、杂种犬与小鼠[7]。斑马鱼与蝾螈作为脊椎动物，其卓越的再生本领为人类心肌再生提供了研究平台；同时，斑马鱼作为已有15年心肌再生研究历史的载体，具有通量高、价格适中、易于养殖、研究周期短、易操作等优点，在相应的研究中发挥了巨大的作用。现将不同种类的动物模型基础研究进行概述。

2.1 哺乳动物的基础研究 19世纪60年代，有学者在出生后的鼠类动物心肌细胞中观察到较低程度的有丝分裂现象[8]。目前认为，哺乳动物发育过程及心肌损伤后的干细胞与原有心肌细胞是较确切的心肌来源，有研究者曾成功将体外分离的鼠源性胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分化为窦房结细胞、心房细胞、浦肯野细胞等不同的心肌细胞[9]。Porrello等[10]切除出生1 d的小鼠约15%的左室心尖后，发现小鼠心脏基本功能在8周内完全恢复，然而同样的损伤模型在出生1周小鼠无法诱导出相同的结果。有研究认为，新生乳鼠心室部分切除后再生能力有限且主要以纤维化瘢痕形成为主，认为不同范围的心尖损伤可能造成心脏再生差异[11]。由此可见，哺乳动物出生前后心肌分化作用最强，之后若通过人为干预可实现心肌再生能力的提高。

通过结扎某些哺乳动物冠状动脉以阻断血流可诱导相应区域的心肌细胞缺血缺氧坏死，此时哺乳动物心脏组织以纤维瘢痕形成为主的炎症免疫反应和人类心肌损伤过程中的表现类似，研究者可进行直观比较。

2.2 斑马鱼的基础研究 Poss等[12]首先发现成年斑马鱼的心脏再生能力。斑马鱼心脏虽然是两腔室，但在细胞分子生物学方面与哺乳动物具有诸多相似之处，其基因组与人类基因组有高达87%的同源性，较多与人类基因功能相似的同源基因[13]。易于操作的遗传分子及全生命周期的心肌再生能力使斑马鱼成为目前研究心脏再生的优秀模型。

小鼠幼体心脏大范围损伤后，心脏组织特异性因子失活而较快死亡，而切除20%左心室后的成年斑马鱼心脏损伤部位并非由瘢痕组织替代，首先出现血凝块之后发生纤维沉积，心尖切除7 d后可在损伤区域检测到增殖的心肌细胞，新生的心肌细胞逐渐生长并于14 d达到峰值，最终在60 d后达到心脏完全再生水平，心肌功能得到恢复[14]。斑马鱼心脏再生过程是心肌早期激活并发育的过程，斑马鱼的心肌再生能力有助于较好地了解和探索哺乳动物心脏再生机制。

2.2.1 心外膜研究 Cai等[15]发现T-box家族中tbx18标记的心外膜干细胞可转化为心肌细胞。Kikuchi等[16]在电耦合切除斑马鱼心室壁后发现，再生过程中具备分裂能力的心肌细胞大量表达锌指蛋白转录因子，而锌指蛋白转录因子受T-box家族转录因子的调控，支持来自斑马鱼心肌再生研究中心外膜在修复心肌损伤中起到的作用。与小鼠类似，斑马鱼新生心脏中发现的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)标记基因snail及twist，体现了斑马鱼损伤后新生心脏中心外膜来源细胞通过EMT形成冠状动脉血管的过程[17]。总之，心外膜激活后可能不直接诱导心肌再生，而是以促进新生血管生长等方式间接发挥作用。

2.2.2 心内膜研究 心肌再生过程中，毗邻心肌层的心内膜与心外膜同时被激活。切除斑马鱼心尖1～3 h后，原有的贴壁扁平细胞从心肌层脱落，转化为圆形细胞并开始表达视黄醛脱氢酶2(retinal dehydrogenase 2，raldh2)，这种变化首先出现于全心，1 d后主要局限于损伤区域并持续约14 d，而心外膜raldh2的表达迟于心内膜[18]。有研究表明，炎症反应导致的心肌细胞损伤可增加心内膜细胞的渗透性，在raldh2作用下维A酸表达增加，切断维A酸表达途径后心肌无法再生[18]。有研究表明，心内膜在嵌入心肌层或离心培养后具有分化为冠状血管内皮细胞的潜能[19]，值得持续关注。

3 心肌再生的相关机制

心肌再生受到多种因素与复杂机制的影响。目前研究方向虽然较多集中于干细胞的诱导分化，但同时开始拓展到其他方面。

3.1 干细胞的研究 有研究证实，通过干细胞移植与诱导分化提高心肌再生水平和心脏功能治疗心脏疾病是可行且充满前景的途径[20-21]。其中，多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)，骨髓源干细胞包括骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、心脏干细胞(cardiac stem cells，CSCs)等均在体外分化为心肌细胞[22-23]。利用干细胞进行心肌再生途径主要包括经典的外源性干细胞注射导入局部损伤区域和采取局部刺激以诱导自身内源性心脏干细胞生长两种方式。

3.2 细胞因子的调控 干细胞的诱导分化主要在各类细胞因子及通路信号调控中完成。抗坏血酸(ascorbic acid，AA)诱导iPSCs向心肌细胞分化的作用强大[24]；在胎肝、肾脏和骨髓分化活跃的造血细胞中常有较高水平的转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，而TGF-βⅡ可促进ESCs转化为心肌细胞[25]；存在于心脑血管中的碱性成纤维细胞生长因子可调控细胞增殖、分化并激活心肌细胞，在BMSCs向心肌转化过程中发挥重要作用[26]。柯伟良等[27]分离出人外周血中的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，培养3 d后与大鼠心肌细胞共同培养，在血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等外源性细胞因子动员下，6 d后EPCs表现出心肌细胞特征与功能。一些与干细胞转移分化有关的细胞生长因子如TGF-β、VEGF、肝细胞生长因子等均可激活与调控心脏干细胞生成心肌细胞[28-29]。

3.3 涉及的相关信号通路 Hippo-Yap信号通路对胚胎时期组织器官发育起着重要的作用，成年小鼠心肌细胞损伤时，通过Hippo-Yap通路再激活可使心肌细胞进入新的细胞周期，促进心肌细胞增殖，且不会对心脏功能造成有害影响[30]。有研究显示，心脏发育过程中的Notch信号发挥促进心脏干细胞增殖分化与心肌修复再生作用，激活Notch信号通路可促进CSCs分化为心肌细胞，而Notch通路被阻断后原有基础心脏病病人极易并发扩张型心肌病[31]。此外，Wnt、骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等通路均不同程度参与心肌细胞的分化过程。除基因因素，心肌细胞修复与再生还受低氧环境、力学刺激等其他因素的影响。

4 中医药在心肌组织再生领域中作用的研究

现代医学中各种原发性或继发性心脏病在急性发作期或终末期归属于中医学“心衰”范畴，病因分为先天不足(如先心病或遗传性心脏病)、久病体衰(如老年病人心脏的退行性病变)、感受外邪(如病毒性心肌炎、感染性心内膜炎)、饮食起居(如糖尿病心脏病)、七情所伤(如高血压心脏病)、劳倦内伤(如机体免疫力下降)等，这些因素相互影响夹杂，最终导致心脏损伤。治疗各类心脏疾病除了应用药物治疗以外，消除危险因素、接受健康教育与调节饮食起居同样重要，中医药治疗在这些方面发挥了一定的作用。

4.1 针灸的作用 手少阴心经分布于两臂上肢掌侧面的尺侧缘与小指的桡侧端，起于极泉止于少冲，通过针灸手少阴心经发挥治疗心胸疾病的作用。李梦等[32]建立大鼠心肌梗死模型后发现相应的心肌坏死组织过量表达CD40配体与基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)，其中CD40配体导致MMP-9过表达，从而诱发急性冠脉综合征，针刺预处理或治疗性模拟针刺大鼠“内关”“心俞”后可降低CD40表达。已有大量临床研究证实针灸治疗心脏病的确切疗效，可作为心肌梗死的辅助治疗，但在疾病过程中减少心肌坏死、促进心肌再生作用的具体机制尚不明确。

4.2 中药的研究 目前，中药及其复方的药理作用机制复杂，对促进心肌细胞分化具体作用靶点的认识不全面，传统的养心方药用于心脏损伤类疾病的治疗和恢复具有悠久的历史，积累了丰富的经验，可能从中寻找合适的药物。现对部分相关中药的研究进行概述并对其作用靶点进行讨论。

4.2.1 调控T-box家族亚型的表达 Brachyury(T)基因作为一类独特的转录因子于1927年首次被人们发现，T-box家族是一类具有同源DNA结构域的基因汇总，其中tbx1、tbx2、tbx3、tbx5、tbx18与tbx20这6个亚型均参与心肌分化[33]。较成熟的tbx5在早期心脏发育过程中主要表达于胚胎中层，在心房、心室发育及心传导系统的形成中发挥重要的作用。一定浓度的女贞子提取物齐墩果酸可增加tbx20的表达并降低氧化型低密度脂蛋白对细胞的损伤，对心肌再生作用有明显影响[34]。中药对T-box这类重要的心脏发育调控因子的研究值得深入开展。

4.2.2 影响TGF-β的表达 TGF-β是一类具有生物活性的多肽，传统认为TGF-β在心肌细胞纤维化、肥大与心脏重构过程中均发挥了作用。TGF-β1与TGF-β3均具有较强的致纤维化作用，而TGF-β2证实参与诱导心肌再生，对血管内皮细胞和造血祖细胞的生长抑制作用仅为前两者的1%左右，且致纤维化作用不强。临床研究表明，具有温阳益气活血的中药与制剂可抑制甚至逆转心肌纤维化。有研究将黄芪、丹参、三七、降香组成的芪参益气滴丸以10-3g/L浓度干预心肌梗死大鼠发现，该制剂通过抑制TGF-β1激活的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路，下调磷酸化的细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular regulated kinase，p-ERK1/2)水平，从而抑制成纤维细胞生长，但对经典Smad通路影响不大[35]。巴戟天寡糖可上调TGF-β2表达，诱导成肌细胞向心肌样细胞分化，其作用受剂量影响呈双向调节[36]。早期心肌梗死过程中TGF-β具有一定的保护作用，通过中药多靶点作用针对性地调控TGF-β，在心肌保护与再生方面具有重要作用。

4.2.3 刺激VEGF的分泌 VEGF可促进心肌微血管生成，为心肌再生提供物质基础，中药对VEGF的作用是多方面的。全反式维A酸作为维A酸的一类活性形式，不仅参与调控VEGF，并且减少大鼠成熟心肌母细胞株H9C2凋亡[37-38]。瓜蒌薤白半夏汤加入黄芪后具有化痰补气之功效，通过增加心肌VEGF 蛋白与mRNA表达可明显改善心肌坏死区供血[39]。有研究者将浓度为10-7mol/L的淫羊藿苷(Icariin，ICA)与MSCs体外共同培养后发现，该浓度ICA不仅引起MSCs高度表达心肌细胞分化过程中需要的一些特定基因，还可增加新生血管VEGF的分泌[40]。

4.2.4 活血化瘀疗法 冠心病属心肌缺血类疾病，中国古代多称为“胸痹”，《诸病源候论》将其描述为“伤之而痛者，则朝发夕死，夕发朝死”，针对这类疾病中医常采用活血化瘀疗法[41]。

5 小 结

心肌细胞再生具有可行性与复杂性兼备的特点：心肌细胞再生存在与功能不同步的矛盾性，不同生物个体之间心脏结构与成分的差异性，时间与损伤部位不同步，具体机制的变化性等。心肌细胞再生效率有限，如何将损伤后的炎症反应限制在可控范围，减少瘢痕生成或逆转瘢痕，提高心肌再生率等问题是目前研究的难点。“道阻且长，行则将至”，心肌再生应用前景广阔，将中医药与现代医学进行有机结合，多角度、深层次探索，以期为心肌细胞丢失的心脏病病人寻找有效的治疗途径。