重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活苗的不同免疫程序对黄羽肉鸡免疫的效果分析

王孝德，禹婷婷，李志贤，虞与理，胡 杰

（1.贺州市动物疫病预防控制中心，贺州542800；2.广西动物疫病预防控制中心，南宁530001）

流感病毒分为A、B、C三型，三型之间的同源性较低[1]。禽流感（avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的急性高度接触性传染病，我国将其列为一类传染病。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科，单股负链RNA病毒，基因组总长13.6 kb，分为8个节段，易于发生变异和病毒重组[2]。

2017年6月前，我国仅对高致病性禽流感（H5亚型）进行强制性免疫。H7N9流感病毒在禽类身上呈现低致病性，但对人类则显现高致病力[3]，感染H7N9流感病毒的禽（鸡）不发病，仅携带病毒[4]。近年来，由于H7N9流感毒株变异逐渐频繁，不断涌现出新的毒株，毒力逐渐增强，H7N9亚型流感病毒变异株对鸡表现超强毒力[5]，发病率和死亡率极高，对家禽危害大，给人民的生命安全构成严重威胁[6]。因此，2017年6月5日农业农村部办公厅要求2017年7月上旬在广东省、广西壮族自治区启动H7N9免疫工作，同时也要求对疫苗的安全性和免疫效力效果进行监测[7]。因此，如何科学、准确评价疫苗效果，对防控禽流感至关重要。国家新推荐使用的重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7- Re1株）免疫程序、免疫效果如何，相关资料报道较少。本实验通过监测黄羽肉鸡不同免疫程序下的抗体消长规律、抗体持续时间、免疫抗体滴度变化情况，评估重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7-Re1株）的免疫效果，为禽流感的综合防控提供理论参考，也为养殖企业或个体养殖户的免疫防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活苗（H5N1Re-8株+H7N9 H7- Re1株），简称（H5+H7）二价灭活苗（下同），哈尔滨维科生物技术开发公司生产，政府采购苗，批号为2017026。

1.2 试验动物本地规模养殖场饲养临床健康的10日龄360只黄羽肉鸡（三黄鸡），随机分成A、B、C 3组，每组120只，用戴脚环的方式进行标记。

1.3 检测试剂禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原和禽流感病毒H5亚型阳性血清以及禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原和禽流感病毒H7亚型阳性血清以及H7N9 H7-Re1株HI抗原和阳性血清，均购自哈尔滨维科生物技术开发公司。其中，禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原和禽流感病毒H5亚型阳性血清批号分别为2017001和2016003，有效期分别至2019年04月27日和2018年11月16日；禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原和禽流感病毒H7亚型阳性血清批号分别为2017007和2017004，有效期分别至2019年4月18日和2019年6月26。1%鸡红细胞悬液稀释液和pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲溶液按GB/T18936-2003中的配方由贺州市动物疫病预防控制中心实验室自配。

1.4 免疫方式及采血时间A组：即在34日龄肌肉注射0.5 mL/只（H5+H7）二价灭活苗，于免疫前0 d及免疫后第14、28、42、56、86 d，分别采集鸡血，分离血清，-20 ℃保存备用。B组：即在10日龄和20日龄鸡，分别颈部皮下注射0.1 mL/只（H5+H7）二价灭活苗；于免疫前0 d、一免后第7 d以及二免后第14、28、42、56、70、100 d，分别采集鸡血，分离血清，-20 ℃保存备用。C组：即在 20日龄和40日龄分别肌肉注射0.5 mL/只（H5+H7）二价灭活苗；于免疫前0 d、一免后第14 d、二免后第8、22、36、50、80 d，分别采集鸡血，分离血清，-20℃保存备用。

1.5 检测方法参照GB/T18936-2003《高致病性禽流感诊断技术》中血凝（hemagglutination，HA）和血凝抑制试验（hemagglutination inhibition，HI）方法对上述血清进行禽流感H5和H7抗体检测；判断标准：抗体滴度≥4log2为阳性，抗体滴度＜4log2为阴性。

1.6 数据分析利用SPSS软件对1.2.2中的检测数据进行抗体平均滴度值、标准差、变异系数、95%的置信区间分析。

2 结果

2.1 没有出现免疫不良反应试验鸡未观察到有精神不振、食欲减退等不良反应。

2.2 禽流感H5抗体情况

2.2.1 抗体阳性率和抗体效价变化情况 由表1可知，A组免疫后第14 d时，抗体水平提升较快，抗体阳性率达到91.67%，抗体平均滴度为6.42log2；B组在一免后第7 d时，抗体阳性率仅为10%，说明有母源抗体的干扰，抗体提升慢，一免时间过早；二免过后第14 d，抗体提升非常迅速，抗体阳性率达到100%，抗体平均滴度为7.43log2；C组一免后第14 d，抗体阳性率为94.17%，抗体提升最快。

2.2.2 禽流感H5抗体消长规律 由图1A可知，A组抗体在免疫前0 d（34日龄）时母源抗体水平低，阳性率为0，说明母源抗体已消退，免疫后第14 d抗体水平快速提升，免疫后第28 d抗体水平达到最高峰，平均滴度为8.09log2，抗体阳性率为96.67%，免疫后第42 d抗体阳性率最高为98.33%，但抗体滴度已经下降到6.33log2，到免疫后第86 d（即出栏时），抗体滴度降为5.99log2，抗体阳性率为89.17%（表1）。

由图1B可知，B组抗体水平在免疫前0 d（10日龄）时抗体滴度为6.42log2，抗体阳性率为87.5%，说明仍存在较高的母源抗体，免疫一针后第7 d，抗体水平很低，仅为1.09log2，说明并未产生抗体，也有可能是母源抗体干扰，一免第10 d后，紧接着二免，二免后第14 d，抗体水平快速提升，抗体滴度达到了7.43log2，抗体阳性率达到100%，二免后第28 d抗体水平达到最高峰，平均滴度为8.45log2，抗体阳性率为100%，二免后第42 d抗体水平开始下降，到二免后第100 d（即出栏时）时滴度已经下降到6.27log2，抗体阳性率为83.33%（表1）。

由图1C可知，C组抗体水平在免疫前0 d（20日龄）时抗体滴度为2.01log2，抗体阳性率仅为6.67%，说明母源抗体基本消退，免疫一针后14 d，抗体水平快速提升，抗体滴度为6.88 log2，抗体合格率达94.17%，一免第20 d后开始二次免疫，二免后第8 d抗体水平开始提升，抗体滴度达7.15 log2，抗体阳性率达99.17%，到二免后第22 d抗体滴度达到最高峰，平均滴度为8.63log2，以后抗体滴度缓慢下降，但抗体阳性率100%状况一直维持到二免后第50 d，到二免后第80 d（即出栏）时滴度已经下降到7.45log2，抗体合格率仍高达为95.83%（表1）。

图1 AIV H5抗体检测结果Fig.1 AIV H5 antibody test results

2.3 禽流感H7抗体情况

2.3.1 抗体阳性率和抗体效价变化情况 由表2可知，A组于34 d日龄实行一针免疫，免疫后第14 d抗体水平有一定提升，抗体平均滴度为4.72log2，抗体阳性率为78.33%；B组在一免后第7 d，抗体阳性率仅为7.5%，说明有母源抗体的干扰，抗体提升慢，二免后第14 d，抗体提升较快，抗体阳性率达到93.33%，抗体平均滴度为5.96log2；C组一免后第14 d，抗体阳性率为93.33%，抗体提升最快，抗体平均滴度为6.88log2。

2.3.2 禽流感H7抗体消长规律 由图2A可知，A组抗体在免疫前0 d（34 d日龄）时母抗体水平低，仅有10%的阳性率，说明母源抗体消退明显，免疫一针后14 d快速提升，免疫后第28 d抗体达到最高峰，平均滴度为7.59log2，抗体阳性率为96.67%，然后抗体逐渐缓慢下降，抗体阳性率变化不明显，免疫后第86 d（即出栏时），抗体滴度降为5.31log2，抗体阳性率86.67%（表2）。

表1 禽流感H5 抗体检测结果Table 1 AIV H5 antibody test results

由图2B可知，B组抗体水平在免疫前0 d（10日龄）时抗体滴度为6.17log2，抗体阳性率为82.5%，说明还存在较高的母源抗体，免疫一针后第7 d，抗体水平很低，仅为1.75log2，说明并未产生抗体，也有可能是母源抗体干扰，一免10 d后进行二免，二免后第14 d，抗体水平快速提升，抗体滴度为5.96log2，抗体阳性率达到93.33%，随后抗体水平不断提升，二免后第42 d抗体达到最高峰，平均滴度为7.58log2，然后抗体缓慢回落，到二免后第100 d（即出栏）时抗体滴度已经下降到5.87log2，抗体阳性率为80.83%（表2）。

由图2C可知，C组的抗体在免疫前0 d（20日龄）时抗体滴度为2.01log2，抗体阳性率仅为6.64%，说明母源抗体基本消退，免疫一针后第14 d，抗体水平快速提升，抗体滴度为6.44log2，抗体合格率达到93.33%，一免20 d后开始二次免疫，二免后第8 d抗体水平开始提升，抗体滴度达7.53 log2，抗体阳性率达到98.33%，到二免后第22 d, 抗体滴度达到最高峰，为8.77log2，以后抗体滴度缓慢下降，到二免后第80 d（即出栏时）时抗体滴度仍有7.43log2，抗体阳性率仍高达为92.5%（表2）。

图2 禽流感H7抗体检测结果Fig.2 AIV H7 antibody test results

3 讨论

3.1 本次试验20日龄和40日龄各免疫一次组（C组）免疫效果较好C组的抗体滴度值、抗体均匀度、抗体高峰期的维持时间均优于其他两组。A组虽然抗体提升也较快，但抗体高峰期维持时间太短，抗体衰减速度快于B组、C组。因此，二次免疫的效果要比一次免疫的效果要好[8]。B组考虑三黄鸡鸡体格较小，一免日龄小，选择的免疫剂量0.1 mL，低于厂家说明书要求的0.3 mL/只，二免后虽然抗体有所提升，但抗体平均滴度低于C组，变异系数大于C组，B组免疫剂量不足是造成B组免疫效果不如C组的原因之一[9]。

3.2 （H5+H7）二价灭活苗的免疫效果好选择的三种免疫程序，用（H5+H7）二价灭活苗免疫的黄羽肉鸡，H5和H7的抗体群体阳性率都达到了农业农村部70%以上的要求。在首免14 d 后，H5 亚型和H7亚型抗体阳性率都可达78.00%以上，与杨泽林等[10]报道的H5亚型首免后第15 d，合格率（阳性率）为10%，首免后22 d，合格率（阳性率）为60%；H5亚型首免15 d后，合格率（阳性率）为70%，首免后第22 d，合格率（阳性率）为93.33%，有些差异。免疫后第14～120 d肉鸡出栏，禽流感H5的抗体水平普遍比H7抗体水平高，H5、H7抗体阳性率都在80%以上。表明（H5+H7）二价灭活苗有较好的免疫效果。

表2 AIV H7 抗体检测结果Table 2 AIV H7 antibody test result

3.3 根据出栏时间的不同可采取有差别的免疫程序可根据本地不同情况，采样不同的免疫程序。对于饲养生长速度慢、饲养期在120日龄左右的黄羽肉鸡规模养鸡场，最好实行首免后第20 d加强免疫，免疫效果更好。在农村散养地区，由于乡村动物防疫力量薄弱的现状，首免后第20 d加强免疫难以全面实施的情况下，可使用一次性免疫，即可在20日龄时，也能获得达到农业农村部要求的免疫效果；对于饲养生长速度快、饲养期在70日龄以下的肉鸡的规模养鸡场，为保障鸡肉的质量安全（疫苗注射后第28 d才可上市销售），可实行一次性免疫或首免后第10 d加强免疫（B组）；在有疫情发生过的区域，用首免后10日加强免疫（B组），使鸡在较短的时间更快的获得保护。