荧光引导下肿瘤手术的现状与未来展望

孙跃民，季福建，刘选文,白晓枫*

(1.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院胰胃外科，北京100021;2.吉林大学中日联谊医院 胃肠结直肠外科，吉林 长春130033;3.吉林市中心医院 普通外科，吉林 吉林132062)

根治性癌症手术的目的是切除肿瘤及清除每一个癌细胞及淋巴组织[1]。术前大量的检查，以确保手术的发病率值得潜在的治愈机会。计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、超声(US)和内镜检查都有助于分期，但它们在术中的应用有限。大体上，外科医生必须根据病变组织和未受损组织之间的视觉和触觉对比，主观上区分肿瘤和正常组织[2]。R0切除术，被定义为显微镜下的阴性边缘，对于外科癌症患者的治愈和长期生存至关重要[3]。 新技术的出现正在彻底改变我们看待和执行癌症手术的方式[4]。术中荧光成像或荧光引导手术(FGS)可以为肿瘤手术中的实时定位、切除和边缘确认提供高保真的肿瘤可视化。与计算机断层扫描和正电子发射断层扫描不同，FGS是在不使用电离辐射的情况下进行的。

1 荧光腹腔镜技术的发展

随着荧光标记肿瘤新技术的出现，有必要开发新的系统来将这种技术整合到手术室中。近年来，荧光激发光增强了腹腔镜手术系统的功能，使其能够在原位小鼠肿瘤模型中成像并观察荧光标记的肿瘤和转移以及周围的解剖结构[5]。理想的系统应该最大限度地提高肿瘤组织的荧光强度，最大限度地减少背景荧光，并保持外科医生可视化周围组织的能力，以便进行空间定位和手术导航。

2 肿瘤选择性荧光标记的研究进展

人们已经开发了多种技术来选择性地用荧光标记分子标记癌细胞，这些技术最终可用于指导和改善癌症手术的结果。随着技术水平的提高，不仅可以用荧光标记手术切除的癌细胞，而且还可以消灭残留的微小癌细胞。

3 抗肿瘤特异性蛋白的单克隆抗体

也许最普遍的方法是将针对已知癌症生物标志物的单克隆抗体与荧光染料结合。使用单克隆抗体针对已知与多种癌症相关的生物标志物——碳水化合物抗原19-9 (CA 19-9)和癌胚抗原(CEA)。针对这些生物标记物的单克隆抗体被偶联到一个绿色荧光团上，创建了一个传递系统，可以靶向胰腺和结肠直肠肿瘤细胞并使它们具有荧光。纯化的抗体-染料结合物在全身性成像或荧光引导腹腔镜检查前24小时被静脉注射到原位人类癌症小鼠模型中。这一广泛适用的技术可用于任何已发现可靠生物标志物的癌症。这一策略为个性化手术医学铺平了道路，因为更复杂的技术可以用于寻找单独的复杂目标和合成靶向治疗。

4 腺病毒载体

端粒酶是一种核糖核蛋白酶，参与染色体末端的复制，其过度表达被认为是癌细胞无限复制潜能的原因[6]。OBP-301和OBP-401是受人类端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控的条件复制5型腺病毒。hTERT是端粒酶的催化亚单位，在癌细胞中高度活跃，但在大多数正常组织中静止。一旦被感染，癌细胞就会获得特定的基因，这些基因被减毒腺病毒所携带。

OBP401是一种减毒腺病毒，含有绿色荧光蛋白(GFP)的基因编码序列，对癌细胞有选择性的细胞毒性。病毒能够进入大多数细胞，但只能在端粒酶活性的存在下复制，端粒酶是恶性细胞的特征，但不是正常细胞。在我们的实验室里，Yano等人评价高剂量瘤内注射OBP-401，并能显示荧光引导手术联合OBP-401治疗软组织肉瘤的疗效[7]。这项技术具有双重能力，照亮肿瘤和破坏微观疾病。研究表明，基于OBP-401的FGS具有无复发、微创、保功能、抑制肺转移等优点。

6 单纯疱疹病毒(HSV)NV1066

单纯疱疹病毒1型突变株NV1066是一种复制能力强的病毒，它在保留正常组织的同时选择性地感染和裂解肿瘤细胞，并携带EGFP的转基因基因[8]。Stiles等人结果表明，经NV1066治疗后，EGFP在体内癌细胞中表达，荧光腹腔镜下可见肿瘤。NV1066的体内外治疗也导致癌细胞死亡[9]。Stanziale等人显示NV1066在腹膜癌细胞内选择性感染和复制，导致肿瘤细胞荧光标记和细胞死亡。当与外科切除结合使用时，溶瘤HSV-1可通过靶向微转移改善局部控制，最终改善长期预后[8]。

7 可激活的细胞穿透肽

另一种癌细胞荧光标记方法利用了在某些癌症中发生的被称为基质金属蛋白酶(MMPs)的切割酶的过度表达。可激活的细胞穿透肽包含带负电的序列，这些序列与细胞静电结合，当被切割时能够进入细胞[10]。它们可以共价结合到包括荧光染料在内的多种分子上，荧光染料允许癌细胞通过受体无关的机制进行标记。Nguyen等人据报道，在人纤维肉瘤和黑色素瘤小鼠模型中，ACPP引导与强光手术相比，显著改善了结果。Metildi等人结果表明，与Cy5和Cy7荧光团结合的MMP-2和MMP-9可切割的比率测量激活细胞穿透肽(RACPPs)能有效地标记原位小鼠胰腺癌模型，并且使用这种方法的FGS可减少转移和复发[11]。

8 吲哚菁绿(ICG)

吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)是fda批准的无毒染料，在700-900 nm波长的近红外光激发下会发出荧光信号。临床使用50多年，安全性指数高(不良反应率为1∶30万，最大推荐剂量为2 mg/kg)[12]。ICG被肝细胞吸收并通过胆汁排出，使该系统能够实时成像肝胆系统。有几种商业上可用的系统用于开腹手术、腹腔镜手术和机器人手术。ICG是一种非选择性荧光团，可在临床上用于显示肿瘤与正常组织之间的相对高/低灌注、胆道解剖、肿瘤与邻近实质间的冲洗差异、客观评价吻合口微灌注及淋巴结定位。

9 临床使用

肿瘤外科的荧光引导成像时代已经到来。随着更多的应用程序被开发出来，新的应用程序继续被描述。新型的、超灵敏的癌症定位和摧毁技术正在从临床前研究进入手术室。荧光成像增强了癌症手术导航，与术前成像、手术期间的视觉检查和触诊相比，具有更高的敏感性。

10 展望

外科医生准确地可视化肿瘤边缘和识别转移灶的能力对于任何癌症手术的成功都是必不可少的。荧光光学成像由于其高灵敏度，低成本，便携性和实时性而具有改善手术结果的巨大潜力。荧光技术的几种不同应用已在临床上使用。现在，外科医生通常使用ICG在腹腔镜胆囊切除术中对胆管进行成像，并在结直肠和食道手术期间评估肠灌注情况。上述进展的一些局限性必须加以解决。首先，我们必须提高靶向癌细胞的能力。癌症是一个很大程度上异质性的疾病过程，一种癌症的基因表达谱与另一种癌症相比可能有巨大的差异。必须制定临床前安全方案，以简化流程，克服与新药相关的巨大财务负担。