银杏叶提取物对血管性痴呆大鼠记忆力及GAT1、CREB表达的影响

徐 睿，王雪鹏,周 兵

(1.北华大学，吉林 吉林132013；2.北华大学附属医院 神经外科，吉林 吉林132011；3.吉林大学校医院 综合外科)

血管性痴呆(VD)是由各种脑血管疾病因素引起脑组织受损、脑循环障碍、而导致的智能损害综合症[1]。氧化应激(OS)是由于机体内发生氧化与抗氧化失衡，从而引起细胞、组织的氧化损伤，其在血管性痴呆的发生与发展的每一个环节中都发挥重要作用[2,3]。奥拉西坦(OX)是环羟基氨基丁酸的衍生物，可有效改善血管性痴呆症状，可促进磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇的合成，增加神经细胞的蛋白质与核酸的形成作用，但是该药临床应用的长期疗效不佳[4,5]。银杏叶提取物(GBE)是一种传统而廉价的中草药，化学成分复杂，是从干的银杏树叶子内提取的药用成分，具有调节血管活性、清除自由基、抗氧化、抗血小板凝聚、调节血管活性等多种作用[6,7]。γ-氨基丁酸转运体-1(GAT-1)与cAMP反应原件结合蛋白(CREB)是脑内重要的抑制性神经递质，在阻断兴奋扩散和传导过程中发挥重要作用[8,9]。本文为此具体探讨了银杏叶提取物对血管性痴呆大鼠记忆力及GAT1、CREB表达的影响，以明确银杏叶提取物的作用效果与机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

SPF级成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(30只)购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证编号00010751，4-5周龄，体重140 g-160 g，饲养环境：温度在22℃-24℃，相对湿度40%-60%，食水自由，12/12 h光照黑暗循环)；奥拉西坦(国药准字H20183388，青岛金峰制药有限公司)；银杏叶提取物标准品(中国食品药品检定研究院，中国)。酶联免疫检测试剂盒(宝生物工程有限公司，中国)，抗GAT1抗体与抗CREB抗体(Sigma公司，美国)，氯仿、异丙醇(国药集团)，无水乙醇(川东化学试剂厂)。

1.2 动物分组与处理

所有大鼠都采用了改良双侧颈总动脉分次结扎的方法制备大鼠血管性痴呆模型，具体措施如下：用浓度为3%的戊巴比妥钠注射液(体重40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿大鼠颈正中线切口切开皮肤，分离双侧颈总动脉与迷走神经。采用0号手术线从血管下穿过，将右侧颈动脉结扎。缝合颈部手术切口并腹腔注射青霉素注射液10万，放回笼中常规饲养。3 d后拆除颈部手术线，进行大鼠左侧颈动脉结扎并进行缝合。造模成功标准：跨越平台时间(逃避潜伏期)显著延长，跨越平台次数显著少于正常大鼠，精神变差，反应迟钝。实验过程中，无大鼠死亡。

把造模成功的大鼠随机分为三组-对照组、奥拉西坦组与银杏组，每组各10只大鼠。对照组造模成功后给予生理盐水10 mg/kg·d静脉注射，连续2周。奥拉西坦组在造模成功后给予奥拉西坦10 mg/kg·d尾静脉注射，连续2周。银杏组大鼠造模成功后给予银杏叶提取物10 mg/kg·d尾静脉注射，连续2周。每次给药过程中，每只大鼠均更换经高压灭菌后导管帽及注射内针，预防感染。

1.3 观察指标

(1)在造模后1 d、7 d与14 d进行水迷宫实验，记录逃避潜伏期。在水迷宫装置自动记录大鼠从入水到寻台成功的时间，即逃避潜伏期，如120 s大鼠仍未找到平台，则潜伏期为120 s。(2)在造模后14 d处死大鼠，迅速分离双侧的海马组织，迅即放入液氮中冷冻，于4 ℃下1 000 rpm，离心15 min，取上清液，采用酶联免疫法检测海马组织IL-1β、IL-6的含量。(3)取海马组织的样本，提取总蛋白，采用Western blot法检测GAT1、CREB蛋白相对表达水平，以β-actin作为内标。(4)取处死大鼠的颈动脉组织，制成病理切片，进行HE染色。然后选择3个含血管组织丰富的区域进行计数，取平均值。

1.4 统计学方法

选择SPSS19.00软件进行数据处理，计量数据选择均数±标准差进行表示，计数数据采用百分比进行表示，本研究多组间数据对比用one-way ANOVA分析，两两比较用t-test分析与卡方分析等，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 逃避潜伏期对比

三组造模后1 d的逃避潜伏期对比差异无统计学意义(P>0.05)，银杏组与奥拉西坦组造模后7 d、14 d的逃避潜伏期低于对照组，银杏组低于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组造模后不同时间点的逃避潜伏期对比(s，均数±标准差)

注：与对照组对比，①P<0.05；与奥拉西坦组对比，②P<0.05.

2.2 病理染色情况对比

对照组：颈动脉血管内膜与邻近细胞层之间距离增宽，血管内弹力层和中弹力层扭曲，斑块基底部存在较多泡沫样改变，内膜下可见增生的平滑肌细胞及堆积的脂质斑块。银杏组：颈动脉壁管腔厚度基本一致，血管平滑肌排列基本规律，血管内膜基本光滑，血管内皮下增生少见。奥拉西坦组：介于对照组与银杏组之间。

银杏组与奥拉西坦组造模后14 d的颈动脉微血管密度高于对照组，银杏组高于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 三组造模后14 d的颈动脉微血管密度对比(血管数/mm2，均数±标准差)

注：与对照组对比，①P<0.05；与奥拉西坦组对比，②P<0.05.

2.3 IL-1β、IL-6含量对比

银杏组与奥拉西坦组造模后14 d海马组织的IL-1β、IL-6低于对照组，银杏组低于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 三组造模后14 d的海马组织IL-1β、IL-6含量对比(pg/ml，均数±标准差)

注：与对照组对比，①P<0.05；与奥拉西坦组对比，②P<0.05.

2.4 GAT1、CREB蛋白水平对比

银杏组与奥拉西坦组造模后14 d海马组织的GAT1、CREB蛋白相对表达水平高于对照组，银杏组高于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，见表4与图1。

表4 三组造模后14 d的海马组织GAT1、CREB蛋白相对表达水平对比

注：与对照组对比，①P<0.05；与奥拉西坦组对比，②P<0.05.

图1 三组造模后14 d的海马组织GAT1、CREB蛋白表达水平

3 讨论

银杏叶为银杏的干燥叶，银杏为银杏科的多年落叶乔木，味甘、苦、涩，性平[10]。银杏叶提取物的主要有效成分包括银杏黄酮和萜类内酯，具有敛肺平喘、化浊降脂、活血化瘀、通经止痛等功效[11]。现代研究表明银杏内酯是天然血小板活化因子受体拮抗剂，可减轻血小板聚集、微血栓形成和脂质代谢紊乱，稳定细胞膜，减少血管紧张素的渗透，改善缺血患者的微循环，对缺血损伤也有很好的保护作用[12]。还有研究认为银杏叶提取物有抗脂质过氧化、清除自由基作用，能够调节机体血脂含量，使血浆超氧化物歧化酶活性增强[13]。本研究显示三组造模后1 d的逃避潜伏期对比差异无统计学意义(P>0.05)，银杏组与奥拉西坦组造模后7 d、14 d的逃避潜伏期低于对照组(P<0.05)，银杏组低于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)；银杏组与奥拉西坦组造模后14 d的微血管密度高于对照组，银杏组高于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，表明银杏叶提取物的应用能改善血管性痴呆大鼠的记忆力，提高颈动脉微血管密度。相关研究也显示中药提取物的应用可以增加大鼠海马部位K+介导的乙酰胆碱的释放，增加大鼠的下丘脑神经元钠钾电流，提升大鼠对空间的认知能力[14]。

炎症因子的表达贯穿血管性痴呆大鼠发生发展的全过程，血清IL-1β、IL-6的表达与痴呆的严重性密切相关。本研究显示银杏组与奥拉西坦组造模后14 d海马组织的IL-1β、IL-6低于对照组，银杏组低于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，表明银杏叶提取物的应用能抑制海马组织炎症因子的释放。当前也有研究显示银杏叶提取物能降低不稳定型心绞痛患者血清炎症因子单核细胞趋化蛋白-1表达水平[15]；也可使缺血脑组织中TNF-α含量降低，能显著减少脑缺血再灌注后中性粒细胞在缺血区脑组织浸润，减轻脑水肿[16]。

GAT-1属于高亲和力的GABA 转运体，在脑组织中的含量比较高。正常情况下，GAT1能够有效的向细胞内转运GABA，减低突触间隙GABA含量，从而终止突触后抑制效应，从而保护神经功能[17]。不过也有研究显示GAT1也可发挥其逆转运功能，增强突触后抑制效应，导致神经功能受损[18]。GABA可保持相关神经元如感觉神经元等活力，修复中枢和周围神经元损伤，增强神经元的再生能力。血管性痴呆可引起炎症系统的激活和氧化应激产生，并对心、肾组织器官产生损伤，从而抑制GAT-1与GABA的表达。本研究显示银杏组与奥拉西坦组造模后14 d海马组织的GAT1、CREB蛋白相对表达水平高于对照组，银杏组高于奥拉西坦组，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，表明银杏叶提取物的应用能提高海马组织GAT1、CREB蛋白相对表达水平。从机制上分析，银杏叶提取物为一种天然药物，成分多样，有多靶点、多环节的防治优势，也具有拮抗血小板活化因子、改善微循环等多种作用，从而可改善血管性痴呆大鼠的认知损伤和海马神经元损伤[19,20]。本研究也有一定的不足，因银杏叶提取物是混合物，其药理机制分析还比较困难，且本研究没有设置空白对照，可能存在研究偏倚，将在后续研究中深入分析。

总之，银杏叶提取物在血管性痴呆大鼠中的应用可促进海马组织GAT1、CREB表达，提高颈动脉微血管密度，抑制炎症因子的释放，从而改善大鼠记忆力。

作者简介：徐睿(1994-)，男，吉林长春人，硕士研究生，主要从事脑血管疾病的研究；王雪鹏(1978-)，男，吉林吉林人，副主任医师，医学博士，硕士研究生导师，主要从事脑血管病、脑肿瘤的诊断与治疗。