慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟生长、抗氧化及免疫指标的影响

管 敏，张德志，唐大明，张厚本

（中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，三峡工程鱼类资源保护湖北省重点实验室，湖北宜昌 443100）

中华鲟（Acipenser sinensis）为大型溯河产卵洄游性鱼类，属国家一级重点保护动物。近年来，由于受到人类活动的影响，中华鲟的自然种群已严重衰退［1-2］。自20世纪70年代始，国内多家研究机构在中华鲟物种保护方面做了大量工作，至2009年，中华鲟在淡水条件下的全人工繁殖技术获得突破［3］，这对于中华鲟的物种保护及其种群复壮具有极为重要的意义。然而，在中华鲟的人工养殖过程中，还存在投喂方式较为粗放、养殖密度较高及水体交换量小等问题，这导致养殖水体中氨氮超标成为一种常态，虽极少达到中华鲟的急性毒性致死浓度，但会对中华鲟造成慢性氨氮胁迫；同时，过高的氨氮易打破养殖系统平衡性，使养殖水体中的病原微生物迅速繁殖，从而导致中华鲟病害频发，这已成为制约中华鲟健康养殖的主要因素之一［4］。因此，研究慢性氨氮胁迫对中华鲟生长、抗氧化及免疫能力的影响，可为中华鲟的人工养殖提供重要的理论指导，对中华鲟的物种保护具有重要意义。

氨氮胁迫会导致水生生物生长缓慢、组织器官病变，抑制其免疫系统功能，扰乱其中枢神经系统，最终致其死亡［5-7］。目前，关于急性氨氮胁迫对鱼类［6，8-10］、虾蟹类［11-13］、头足类［7］、棘皮动物类［14］影响的研究报道较多，而关于氨氮对中华鲟慢性毒性的研究尚未见报道。本实验在慢性氨氮胁迫条件下，研究了子二代中华鲟生长、抗氧化及免疫指标的变化情况，旨在探讨慢性氨氮胁迫对其代谢水平和生理状况的影响，从而为子二代中华鲟的健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验鱼为湖北省宜昌市中华鲟研究所2014年全人工繁殖所得的子二代中华鲟 （3＋龄）。随机挑选规格一致、体质健康的子二代中华鲟24尾，体质量为 （2.62±0.16）kg，体长为（84.20±1.50）cm。

1.2 实验设计

实验在4个直径4.0 m、水深0.8 m的实验池中进行，氨氮浓度设置为0.01 mg·L-1（对照组）、0.5 mg·L-1（低质量浓度组）、1.0 mg·L-1（中质量浓度组）、2.0 mg·L-1（高质量浓度组），每个浓度组6尾鱼。实验开始前，用120 mg·L-1MS-222将中华鲟进行麻醉，然后称重并测全长和体长，最后将其转至实验池中暂养，3 d后开始实验。暂养和实验期间，溶氧6.0～7.0 mg·L-1，pH 7.3～7.6，亚硝酸盐低于0.01 mg·L-1；暂养期间水温（16.8±0.5）℃，实验期间水温16.8～21.5℃。氨氮浓度用10 g·L-1的NH4Cl母液进行调配，实验池水每24 h换一次；每天投喂1次，投喂量为0.9 kg，摄食完成后及时清除残饵，并观察记录鱼的摄食及活动状态，实验持续60 d。

1.3 样品的采集和处理

取样前，用120 mg·L-1MS-222将试验鱼进行麻醉，然后臀鳍基部抽血，静置1 h后3 500 r·min-1离心10 min，取上层血清保存于2 mL离心管中，经液氮快速冷冻后，-70℃保存待测。将试验鱼解剖，对内脏团和肝脏进行称重，然后取肝脏并将其切成小块，置于2 mL离心管中，经液氮快速冷冻后，-70℃保存待测。

1.4 测定指标

计算成活率 （SR）、增重率 （WGR）、特定生长率 （SGR）、肝体比 （HSI）、肥满度 （CF）和脏体比 （VSI），计算公式为：

成活率 （SR，%）=100×Nf／Ni

增重率 （WGR，%）=100×（Wt-W0）／W0

特定生长率 （SGR，%·d-1）=100×（lnWt-lnW0）／t

肝体比 （HSI，%）=100×Wh／Wb

肥满度 （CF，%）=100×（Wb／L3）

脏体比 （VSI，%）=100×We／Wb

式中，Nf为终末鱼尾数；Ni为初始鱼尾数；Wt为终末体质量 （g）；W0为初始体质量 （g）；t为实验天数 （d）；Wb为每尾鱼体质量（g）；L为每尾鱼体长（cm）；Wh为肝脏质量（g）；We为内脏团质量 （g）。

抗氧化指标包括超氧化物歧化酶 （SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、总抗氧化能力（TAOC）活性、谷胱甘肽（GSH）含量、丙二醛（MDA）含量；免疫指标包括溶菌酶 （LZM）活性和免疫球蛋白M（IgM）含量。所有指标的测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体方法参见其说明书。

1.5 数据统计

实验数据用SPSS 16.0和Excel 2016软件进行统计分析，利用单因素方差分析 （One-Way ANOVA）和Duncan’s多重比较检验慢性氨氮胁迫对各项指标影响的显著性，差异的显著性以P＜0.05为标准，结果以平均值 ±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟行为及生长性能的影响

在各氨氮处理组中，随着氨氮浓度的升高，中华鲟表现出一定的应激行为，主要体现在呼吸频率增加，食欲减退，摄食率下降；实验结束时，各组试验鱼的成活率均为100%。慢性氨氮胁迫虽未对子二代中华鲟的存活造成影响，但却对其生长产生了显著的抑制作用 （表1）。随着氨氮浓度的增加，子二代中华鲟的增重率和特定生长率逐渐降低，且中、高浓度组显著低于低浓度组和对照组（P＜0.05）；低、中、高浓度组试验鱼的脏体比和肝体比均低于对照组，但无显著性差异（P＞0.05）；此外，各组试验鱼的肥满度也无显著性变化 （P＞0.05）。

表1 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟生长指标的影响Tab.1 Effect of chronic ammonia stress on growth index of F2 Acipenser sinensis

2.2 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟抗氧化指标的影响

2.2.1 SOD活性

随着氨氮浓度值的增大，子二代中华鲟血清、肝脏SOD活性逐渐下降 （图1）。低、中、高浓度组血清 SOD活性分别为72.38、67.89、59.21 U·mL-1，较对照组分别下降 9.28%、14.91%和25.79%；肝脏 SOD活性分别为 217.55、203.77、194.04 U· mg-1prot，较 对照组 分别 下降12.20%、17.77%和 21.69%；其中，低浓度组和对照组与中、高浓度组存在显著性差异 （P＜0.05）。

图1 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清、肝脏SOD活性的影响Fig.1 Effect of chronic ammonia stress on SOD activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.2 CAT活性

子二代中华鲟血清、肝脏CAT活性变化如图2所示。氨氮浓度值越大，血清和肝脏CAT活性越小。对照组血清CAT活性为1.20 U·mL-1，分别是低、中、高浓度组的1.24、1.27和1.57倍，但各组之间差异不显著（P＞0.05）；对照组肝脏CAT活性为15.61 U·mg-1prot，分别是低、中、高浓度组的 1.13、1.30和 1.50倍，且对照组与中、高浓度组存在显著性差异 （P＜0.05）。

图2 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏CAT活性的影响Fig.2 Effect of chronic ammonia stress on CAT activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.3 GSH含量

子二代中华鲟血清、肝脏GSH含量变化如图3所示。各处理组试验鱼血清、肝脏GSH含量依次表现为对照组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组，高浓度组中华鲟血清、肝脏GSH含量显著低于对照组 （P＜0.05），较对照组分别降低42.42%和 65.24%。

图3 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏GSH含量的影响Fig.3 Effect of chronic ammonia stress on GSH content in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.4 T-AOC活性

子二代中华鲟血清、肝脏T-AOC活性变化见图4。随着氨氮浓度的升高，试验鱼的血清、肝脏T-AOC活性逐渐降低，低、中、高浓度组血清 TAOC活性较对照组分别下降了15.85%、41.46%和47.15%，肝脏T-AOC活性较对照组分别下降20.24%、30.79%和 33.46%。

图4 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏T-AOC活性的影响Fig.4 Effect of chronic ammonia stress on T-AOC activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.5 MDA含量

在慢性氨氮胁迫条件下，子二代中华鲟血清、肝脏MDA含量的变化情况见图5。各氨氮处理组血清、肝脏MDA含量由大到小依次为高浓度组、中浓度组、低浓度组和对照组；其中，高浓度组血清 MDA含量显著高于对照组 （P＜0.05），中、高浓度组肝脏MDA含量均显著高于对照组和低浓度组 （P＜0.05）。

图5 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏MDA含量的影响Fig.5 Effect of chronic ammonia stress on MDA content in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.3 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟免疫指标的影响

2.3.1 LZM活性

子二代中华鲟血清、肝脏LZM活性随氨氮浓度升高而显著降低（图6）。与对照组和低浓度组相比，高浓度组血清 LZM活性分别降低26.77%和23.45%，之间存在显著性差异 （P＜0.05）；高浓度组肝脏LZM活性与对照组也存在显著性差异 （P＜0.05）。

2.3.2 IgM含量

子二代中华鲟血清、肝脏IgM含量变化情况见图7。氨氮浓度越高，血清、肝脏IgM含量越低，中浓度组血清、肝脏IgM含量较对照组分别下降17.21%和34.11%；高浓度组血清、肝脏IgM含量较对照组分别下降25.07%和43.64%；中、高浓度组与低浓度组、对照组均存在显著差异 （P＜0.05）。

图6 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏LZM活性的影响Fig.6 Effect of chronic ammonia stress on LZM activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

图7 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟血清和肝脏IgM含量的影响Fig.7 Effect of chronic ammonia stress on IgM content in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

3 讨论

3.1 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟生长的影响

氨氮是评估水环境好坏的重要指标，其浓度升高会对养殖鱼类造成胁迫作用。研究发现，氨氮胁迫会显著降低尼罗罗非鱼［8］（Oreochromisniloticus）、黄颡鱼［15］（Pelteobagrus fulvidraco）、大菱鲆［16］（Scophthalmus maximus） 、舌 齿 鲈［17］（Dicentrarchus labrax） 幼 鱼、塞 内 加 尔 鳎［18］（Solea senegalensis） 、大 西 洋 比 目 鱼［19］（Hippoglossushippoglossus）等鱼类的生长速率，使其生长缓慢甚至停滞，本研究所得结果与其相同。在本研究中，慢性氨氮胁迫未造成子二代中华鲟死亡，但对其摄食、生长造成了严重影响。试验鱼的增重率和特定生长率随氨氮浓度的增加而显著降低，这说明慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟的生长产生了显著抑制作用，其原因可能为氨氮浓度的升高影响了鱼类的消化生理功能，致其消化酶活性降低，食欲下降，摄食量减少，从而导致鱼体生长缓慢［20］。

3.2 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟抗氧化能力的影响

愈来愈多的研究者认为，鱼类氨中毒致死可能与机体氧化损伤和免疫抑制有关［21］。鱼类长期处于氨氮胁迫中，机体内源性氨的排泄被阻断，外源性氨经鳃和皮肤进入体内并大量积累，产生大量氧自由基 （ROS），从而对鱼体造成损伤［22］。为了消除体内过多的ROS，维持 ROS的动态平衡，鱼类进化出一套完整的抗氧化防御体系。衡量该系统功能的综合性指标为总抗氧化能力（T-AOC），它可以反映机体应对外来胁迫的能力［23］，另外，超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化氢酶（CAT）是抗氧化防御体系中非常重要的功能酶［24］，其活性大小代表机体清除ROS能力的高低［25］。

本研究中，慢性氨氮胁迫显著降低了子二代中华鲟血清、肝脏SOD、CAT和T-AOC活性，这与鲻（Mugil cephalus）［26］、吉富罗非鱼 （GIFTOreochromis niloticus）［27］的研究结果相同，其原因可能与氨氮胁迫抑制抗氧化酶合成有关。在一定的范围内，鱼体可通过改变相关基因表达水平调节蛋白质的合成量，进而调控体内酶的合成［28］。当氨氮胁迫程度超过鱼体耐受后，机体为减少体内分子氨的积累，可能会降低蛋白质和氨基酸的分解代谢［29］，从而导致鱼体 T-AOC、SOD和CAT活性显著下降。然而，姜会民［30］、SUN等［31］研究得出不同结论，这可能与鱼体在低氨氮条件下产生毒物兴奋效应有关［29］。

谷胱甘肽（GSH）是一种低分子自由基清除剂［32］，是清除 ROS非常重要的非酶抗氧化物质［33］，而丙二醛 （MDA）是 ROS与脂质发生过氧化反应的产物，它能够加剧细胞膜的损伤，可以反映组织细胞受ROS攻击的程度，从而间接反映机体抗氧化能力的强弱［32，34］。随着氨氮浓度的升高，子二代中华鲟血清、肝脏GSH含量显著下降，MDA含量显著升高，这与鲻幼鱼［26］、福瑞鲤 （Cyprinus carpio）［35］、黄颡鱼幼鱼［36］的研究结果相同。结果表明持续60 d的慢性氨氮胁迫使鱼体GSH大量消耗，并显著加剧了组织细胞膜脂质过氧化程度，醛酮类物质在鱼体内不断积累，这也间接反映机体抗氧化能力正逐渐减弱。

3.3 慢性氨氮胁迫对子二代中华鲟免疫指标的影响

溶菌酶（LZM）和免疫球蛋白M（IgM）是鱼体非常重要的免疫因子，前者可以破坏革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖，从而瓦解细菌细胞［37］；后者具有强大的抗感染作用。本研究中，随着氨氮胁迫浓度的增大，子二代中华鲟血清和肝脏LZM活性及IgM含量均表现为逐渐降低的趋势。这表明慢性氨氮胁迫显著降低了鱼体溶菌酶的活性及IgM的合成，对鱼体的免疫功能产生了显著的抑制作用，显著降低了鱼体的免疫力。这与黄颡鱼幼鱼［37］、奥尼罗非鱼［38］（Oreochromis niloticus×O.areus）、吉富罗非鱼［39］的研究结果相同，其原因可能为鱼类受氨氮胁迫时，大量免疫抑制因子会在外围淋巴组织中产生，并逐渐被释放到血液中，从而影响巨噬细胞和淋巴细胞的含量及活性，进而抑制免疫应答［40］。

本研究发现持续60 d的慢性氨氮胁迫导致子二代中华鲟的特定生长率和增重率显著下降，血清、肝脏 SOD、CAT、T-AOC、LZM活性、GSH及IgM含量显著下降，MDA含量显著升高，这表明慢性氨氮胁迫对中华鲟的生长、抗氧化能力和免疫能力产生了显著的不利影响，本研究结果对了解中华鲟氨氮胁迫反应以及其健康养殖具有重要的借鉴意义。