唾液生物标志物在口腔癌筛查中的应用

黄璐 戴杰 吴燕岷

1.浙江大学医学院附属第二医院口腔内科 杭州 310009；2.杭州市大江东医院口腔科 杭州 311225；3.台州医院路桥院区口腔科 台州 318050

口腔癌是一种头颈癌，是一个严重的全球公共卫生问题，属于人类最常见的恶性肿瘤，5年死亡率约为50%，其中最为常见的是口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma）[1]。口腔癌的存活率取决于准确的部位和确诊时的癌症分期。2011年SEER数据库显示，在考虑初始诊断阶段、性别、种族、年龄组和治疗方式的情况下，口腔癌患者的5年存活率约为57%，其中T1期癌症患者的生存率大约能达到90%。因此，强调早期发现以提高患者的生存率，但是各种原因往往导致患者确诊时已经处于癌症晚期（T3～T4期）[2-3]，严重影响了口腔癌的预后。

目前应用于口腔癌检测的标准方法仍然是全面的临床检查、昂贵的生化检测和具有侵入性的活组织检查，所以寻找从生物体液（血液、尿液、唾液）中用于鉴定的生物标志物具有早期诊断的潜在价值[4]。已有多项研究[5-6]证明唾液中含有的许多成分能够反映患者在病理条件下的代谢水平；在唾液中已经发现了100多种可能作为诊断口腔鳞状细胞癌的潜在生物标志物[7]。本文在简单介绍口腔癌及唾液生物标志物的基础上，回顾汇总了口腔鳞状细胞癌相关领域的潜在唾液生物标志物，从多个环节分析了研究中存在的一些问题与挑战，对唾液生物标志物在口腔鳞状细胞癌领域的应用价值及未来发展趋势进行了探讨。

1 唾液生物标志物简介

唾液是由唾液腺分泌液、龈沟液和黏膜渗出液等构成的混合性液体，储存了大量的人类口腔微生物和口腔局部组织以及身体其他部位感染微生物的DNA、RNA、蛋白质及代谢产物。另一方面，生物标志物是正常生物学、病理学过程和对治疗的药理学反应过程中变化的分子特征与指标，可以为疾病的检测、诊断和预后提供有用的信息。唾液是一种生物标志物检测的理想诊断介质，其取材具有不侵袭性、易于采集、携带方便、贮存与运输成本低等优点[8-9]。

唾液中蛋白质含量较低，成份比血清简单[10-11]。血液或血清中有大量的分子，这使得检测低含量和相对隐蔽的生物标志物变得困难。与血液不同的是，唾液中的生物标志物被稀释并易于获取，可以使用高灵敏度的扩增技术进行检测，比如酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、Luminex xMAP液相芯片技术[12]、承载着纳米金属颗粒的微流控芯片检测技术[13]、电化学磁珠生物传感器[14]。这些特性使唾液成为发现生物标志物的理想生物液体[15-16]。此外，口腔癌和口咽癌与唾液的直接接触使唾液成为检测这些癌症类型的高特异性的、高灵敏性的潜在筛查工具。

2 有关口腔癌及癌前筛查中潜在唾液生物标志物的研究进展

在口腔癌和癌前病变的诊断和检测方面，关于唾液蛋白质组学、代谢组学、基因组学和转录组学的研究很多。目前已有多种基于唾液的生物标志物被用于早期发现口腔癌及癌前筛查[4,17-61]。从1992年底到现在，已有超过100项研究发表了120多种潜在唾液生物标志物（DNA、RNA、蛋白质），包括细胞因子[白细胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β、肿瘤坏死因子-α等]、防御素-1、抑癌基因p53、角蛋白（Cyfra）21-1、组织多肽特异性抗原（tissue polypeptide specific antigen）、双特异性磷酸酶（dual specificity phosphatase）、亚精胺/精胺-N1-乙酰转移酶（spermidine/spermine N1 acetyltransferase）、肌动蛋白（profilin）、丝切蛋白（cofilin）-1、转铁蛋白（transferrin）等，这些被认为是口腔癌及癌前诊断的潜在生物标志物。

为了对唾液生物标志物在口腔癌及癌前筛查方面的研究进行回顾性分析，笔者在PubMed数据库进行了文献检索，检索词包含：“saliva”、“salivary”、“biomarker”、“oral cancer”、“precancer”（检索词单独或几个配对进行检索）；文献发表时限设置为1995年1月至2018年6月。排除综述、论述、技术类文章等非研究性论文之后，进一步对文献标题及摘要进行阅读，去掉以下文献：1）研究对象非人类；2）缺乏对照或患者群体；3）研究方法缺乏清晰描述。最终筛选出的文献是通过比较人类正常对照组和口腔癌患病组来研究该领域的潜在唾液生物标志物的研究型论文，共计61篇。

2.1 样品的采集方法

在所有的61项研究中，有47项研究表明是对整个唾液和特定的腺体唾液都进行了分析；在分析未刺激和刺激后采集唾液之间，有42项研究选择了刺激后收集唾液进行分析；39项研究考虑了在采样前不同时期的口腔刺激，如饮食和口腔卫生习惯；大多数研究收集唾液的时间是早上，但没有提到准确的收集时间。

2.2 样品检测前的处理方式

在唾液取样后，通常采用离心去除固体成分（包括食物残渣），但是不同研究采用的离心参数不同，包含以下方案：800g离心10 min、2 000g离心10 min、2 600g离心15 min、2 000 r·min-1离心5 min、14 000 r·min-1离心20 min等[4,17-61]，其中也有少数研究在不离心的情况下直接对整个唾液进行评估[56-57]。一般情况下，先冷冻样品，在进行后续分析之前才取出离心，所以大多数有关唾液生物标志物的研究只分析了唾液样本中不包含细胞的部分，但是唾液中70%的DNA来自于口腔黏膜细胞，离心处理导致了一些潜在生物标志物的遗漏。另外，少数研究会使用RNA酶或蛋白酶抑制剂来减少唾液RNA和蛋白质的降解[49,58-59]；大多数研究中并没有添加任何抑制剂，都是直接离心后将上清样品储存在-80～4 ℃环境中[40]，但是信使RNA（messenger RNA，mRNA）性质特别不稳定，在几分钟内就可以完全降解；仅有3项研究是立即分析样本。

2.3 样品的检测方法

在唾液生物标志物的检测方面，常见的检测技术有二维凝胶电泳、ELISA、Luminex xMAP液相芯片技术、蛋白质定量（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）等。因为每项研究采用的检测方法都不一致，不同研究相同标志物的水平差异较大，无法进行对比。为了加快唾液生物标志物在临床上的使用，很有必要对其样品的采集、储存及分析等进行规范化，在此基础上通过不同的基础研究找出潜在的唾液生物标志物，最终应用于临床测试。

2.4 研究对象的选择

大多数的研究在选择患者时并没有特定的选择标准，仅仅是将收集到的所有患者及正常人进行汇总，在此基础上得到的结果往往可靠性相对不强，建议在选取研究对象时，设定一个明确的筛选标准，比如年龄、性别、临床表型程度等，尽量缩小组内和组间的个体差异。本文对已报道的口腔癌及癌前诊断的唾液生物标志物进行了整理（表1）。

续表1

续表1

2.5 其他因素对检测结果的影响

口腔作为一种微环境，其外伤、牙菌斑、牙龈炎、牙周炎、真菌感染等疾病都会导致微生物、促炎细胞因子等的变化，在一定程度上会影响口腔癌和癌前病变的唾液生物标志物水平。因此，为了验证口腔癌特定唾液生物标志物的可靠性，需要对具有普通非肿瘤性口腔炎性疾病的个体进行可能的唾液生物标志物的研究。但是，在不考虑其他炎症条件的情况下，建议尽可能根据唾液生物标志物水平来诊断口腔癌、癌前病变。

许多潜在的口腔癌唾液生物标志物，如8-羟基脱氧鸟苷和丙二醛在肺癌和乳腺癌等不同癌症中也会发生改变[60-61]，说明多个唾液生物标志物可能会因一种以上癌症的存在而显著改变，在这种情况下可以考虑唾液生物标志物联合检测口腔癌，增加诊断结果的可靠性及特异性。然而，有关唾液生物标志物联合诊断口腔癌的研究很少，需要进一步的深入。已研究报道的多种唾液生物标志物联合检测情况汇总见表1。

2.6 唾液微生物作为潜在生物标志物的应用价值

就唾液微生物种类而言，虽然已有研究证明正常人和口腔癌患者的微生物种类和数量存在差异，比如流感嗜血菌、棒杆菌、卟啉单胞菌、罗卡利马氏体、芽孢杆菌等[47]。但是，微生物之间的差异受多种因素（比如年龄、性别等）综合影响。因此，有关唾液微生物在口腔癌中应用的研究还需要进一步深入，笔者认为将微生物作为潜在的生物标志物的临床应用价值不大。

2.7 应用于口腔癌筛查所面对的问题与挑战

从多个方面对检索到的文献进行统计分析后，笔者发现有关唾液生物标志物在口腔癌及癌前筛查领域的研究尚处于早期阶段，很多相关问题及挑战亟待解决。例如：唾液样本的采集、处理和储存缺乏标准化；口腔癌、癌前和健康个体的潜在唾液生物标志物水平存在广泛的不一致性和不稳定性，唾液生物标志物的特异性及灵敏性有待进一步验证；微小RNA、长链非编码RNA、环状RNA等[41-42]最新RNA领域研究相对空白，尚无可单独用于口腔癌诊断的唾液指标；需要标准化口腔唾液生物标志物，以适应不同的慢性口腔炎性疾病和其他类型的癌症患者；为了排除其他癌症对唾液生物标志物水平的影响，提高口腔癌及癌前筛查的诊断效果，可以合理联合检测多种唾液生物标志物。使唾液生物标志物在临床诊断标准中标准化的步骤可归纳为3步：1）唾液样本采集、处理和分析方法的标准化；2）明确非癌症患者和癌症患者中不同水平的唾液生物标志物；3）唾液生物标志物的确认。

3 唾液生物标志物的未来展望

唾液易于采集、处理、储存，且含有高质量的DNA，是血液的完美替代品。唾液组学的研究对于识别疾病的高特异性及灵敏性生物标志物和潜在的药物靶点具有重要作用。唾液基因组学还具有遗传筛查、早期疾病诊断的潜力。目前，唾液及其在疾病诊断中的应用研究仍处于初级阶段，由于缺乏标准化的方法和技术，这些研究的进展受到了限制，且相互之间可比性很低，因此急需开发一套唾液生物标志物的标准化鉴定系统。唾液组学的系统知识网络和疾病的精确生物标志物有助于更好地理解口腔健康和系统健康之间的关系，这将促进精准医学的应用，促进精准、无痛、方便的靶向治疗的个性化。